制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用技术

本发明专利技术公开一种制备人脂肪干细胞培养液的方法及其应用，包括以下步骤：使用胰酶和胶原酶联合消化人源脂肪组织，待溶液分为三层，取下层，制得脂肪干细胞沉淀液；加入L‑DMEM完全培养基中终止消化并进行原代培养；对原代脂肪干细胞进行传代培养，该过程中提供O2分压为1～5％、CO2分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm

【技术实现步骤摘要】
制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用
本专利技术涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用。
技术介绍
脂肪干细胞是从脂肪组织中获得的间充质干细胞，自2001年首次从脂肪组织中分离、提取出脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)并命名以来，ADSCs因来源广泛、取材方便、组织损伤小、扩增迅速等优点已成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具。众多研究发现，ADSCs在体内损伤修复、抗衰老等方面均可发挥较为显著的作用；其生物学作用的实现一部分通过多向分化能力，ADSCs可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱等多种细胞，补充替代老化、缺损的组织细胞；另一部分通过旁分泌功能，ADSCs可合成及分泌多种细胞因子、多肽类、气体分子等活性成分，提高受损细胞的生命力和抗凋亡能力。干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，幼稚的干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于干细胞移植后成活率较低，干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。ADSCs分泌的生物活性因子种类繁多。在体外培养脂肪干细胞的过程中，该细胞会将上述具有生物活性因子分泌到培养基中，形成脂肪干细胞条件培养基(Adipose-derivedstemcellsconditionedmedium，ADSC-CM)。ADSC-CM中含有VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF和KGF等多种活性成分。在ADSC-CM中还检测到多种抗氧化物质，包括IGF、IL-6、超氧化物歧化酶2(Superoxidedismutase2，SOD2)和肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)，对机体多种组织器官有抗氧化保护作用。例如，IGF可以保护成纤维细胞和肠上皮细胞免受自由基损伤；HGF保护视网膜色素上皮免受由于谷胱甘肽减少造成的氧化损伤；白介素-6(Interleukin-6，IL-6)可以减少过氧化氢造成的细胞死亡。因此，目前研究认为，ADSCs主要通过旁分泌的作用方式，分泌大量活性细胞因子，从而产生抗组织老化的作用。紫外线照射引起的光老化是导致皮肤衰老的最主要外因。研究表明，ADSCs所分泌的胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素1和肿瘤坏死因子α，可改善中波紫外线引起的皮肤成纤维细胞损伤，加强成纤维细胞增殖及合成胶原蛋白的能力，其中转化生长因子β在体外实验中刺激成纤维细胞的作用最强。皮肤黑色素是由位于表皮基底层的黑素细胞合成的。当黑素细胞受到外界刺激(紫外线、化学刺激、情绪压力等)时会合成黑色素，导致皮肤颜色变深。酪氨酸为黑素细胞制造黑素的主要原料，酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑素过程中的主要限速酶。ADSCs分泌的转化生长因子β1可通过下调酪氨酸酶活性减少酪氨酸酶相关蛋白的表达，最终抑制黑色素的合成，起到美白皮肤作用。研究表明，光老化造成的皮肤损伤与慢性难愈伤口的病理改变相似。真皮细胞外基质的胶原成分是皮肤张力和弹性回缩力的结构基础，其改变会导致光老化和创口难愈。恢复老化皮肤组织自我修复能力的关键是促进成纤维细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原，重塑致密规律排列的胶原组织。研究证实，在损伤区皮肤中，ADSCs可分泌多种细胞因子和生长因子，募集巨噬细胞，促进肉芽组织和血管生成，并向内皮细胞和表皮细胞分化。但最主要的作用还是激活成纤维细胞促进伤口愈合。无论是两种细胞接触培养,还是通过ADSC-CM对成纤维细胞进行培养，都可以促进成纤维细胞的增殖。ADSCs可以分泌IGF结合前体蛋白、PDGF、KGF、VEGF和纤连蛋白等，这些因子具有促进毛发生长的作用。ADSC-CM培养，可使真皮乳头细胞的增殖能力增强，更多毛囊进入生长期，代表增殖能力的信号蛋白pAkt、pErk表达增高。适量浓度的ADSC-CM能够加速体外培养的毛发生长。体内动物实验中，皮内注射ADSCs或是皮肤外涂抹ADSC-CM，都有明显促进毛发再生的效果。目前，脂肪干细胞的体外培养方法还没有同一标准，影响最终获得脂肪干细胞的质量与数量。此外，脂肪干细胞的旁分泌作用受到多种因素影响，直接关系到将脂肪干细胞的旁分泌物质作为活性成分的产品的治疗作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种培养人脂肪干细胞的方法及其护肤美容上的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。根据本专利技术的一个方面，提供一种制备人脂肪干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶和0.1vol％胶原酶联合消化人源脂肪组织，消化20分钟后，液面分为三层，上层为脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，取下层液体，采用换液方式冲走溶液中的红细胞，制得脂肪干细胞沉淀液；步骤b.将脂肪干细胞沉淀液加入L-DMEM完全培养基中终止消化并进行脂肪干细胞原代培养；步骤c.用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA对原代脂肪干细胞进行消化传代，传代培养过程过程中提供O2分压为1～5％、CO2分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm2的低剂量紫外线照射，并在培养过程中加入1×10-7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；步骤d.将脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。优选地，在所述步骤c中，O2分压为3％。优选地，在步骤b和步骤c的培养过程中加入维生素C、维生素D3、T肿瘤坏死因子-α或血小板衍生因子中的一种或多种。优选地，在步骤c中，提供20mJ/cm2的紫外线照射。本专利技术还提供采用上述的方法制备得到的人脂肪干细胞培养液。本专利技术还提供上述的培养液在护肤美容用品中的应用。本专利技术还提供一种护肤美容用品，其特征在于：含上述的人脂肪干细胞培养液。优选地，护肤美容用品包括清洁类产品、美白除皱类产品以及化妆类产品。优选地：清洁类产品包括洗手液、沐浴产品、洗发护发产品、洁面产品和卸妆产品；美白除皱类产品包括：润肤霜、爽肤水、收缩水、化妆水、乳液、日霜、晚霜、精华液、眼霜、护手霜、防裂膏、精华液；化妆类产品包括：妆前乳、隔离霜、粉底霜、唇膏、胭脂、花露水、香粉和面膜。优选地，护肤美容用品为乳液，除了水分，其含有重量百分比为5～10％的所述脂肪干细胞培养液，且还含有如下重量百分比组分：本专利技术通过胰酶和胶原酶联合消化人源脂肪组织，可大大缩短消化时间，从而避免了酶对细胞的过度损伤；此外，与传统使用NH4Cl破坏红细胞而排出红细胞干扰的做法相比，本专利技术通过换液的方法去除红细胞，2次换液后红细胞基本消失，这样避免了NH4Cl对细胞的损伤。因此，使用本专利技术提供的技术方案，每500mg脂肪组织平均可获得5×105个干细胞，比一般的传统方法的细胞获得率高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备人脂肪干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶和0.1vol％胶原酶联合消化人源脂肪组织，消化20分钟后，液面分为三层，上层为脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，取下层液体，采用换液方式冲走溶液中的红细胞，制得脂肪干细胞沉淀液；步骤b.将所述脂肪干细胞沉淀液加入L‑DMEM完全培养基中终止消化并进行脂肪干细胞原代培养；步骤c.用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA对原代脂肪干细胞进行消化传代，传代培养过程中提供O2分压为1～5％、CO2分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm2的低剂量紫外线照射，并在培养过程中加入1×10‑7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；步骤d.将所述脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。

【技术特征摘要】
1.一种制备人脂肪干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶和0.1vol％胶原酶联合消化人源脂肪组织，消化20分钟后，液面分为三层，上层为脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，取下层液体，采用换液方式冲走溶液中的红细胞，制得脂肪干细胞沉淀液；步骤b.将所述脂肪干细胞沉淀液加入L-DMEM完全培养基中终止消化并进行脂肪干细胞原代培养；步骤c.用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA对原代脂肪干细胞进行消化传代，传代培养过程中提供O2分压为1～5％、CO2分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm2的低剂量紫外线照射，并在培养过程中加入1×10-7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；步骤d.将所述脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。2.如权利要求1所述制备人脂肪干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤c中，O2分压为3％。3.如权利要求1所述制备人脂肪干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤b和所述步骤c的培养过程中加入维生素C、维生素D3...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏色东，
申请(专利权)人：深圳市乔水生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44