一种间充质干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养的技术领域，公开了一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括血清替代物、其他蛋白以及营养因子；本发明专利技术提供的一种间充质干细胞无血清培养基，具有以下优点：(1)、无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。(2)、本发明专利技术配置的无血清培养基，在细胞培养效果上能达到进口水平，基础培养基来源充足不受市场影响。(3)、简化细胞分离步骤，组织消化后的细胞即可直接用于原代培养，并保证培养细胞的专一性。(4)、使用本发明专利技术的培养基，细胞保持良好的贴壁性，呈现出梭形的成纤维细胞形态，同时经多代培养后，细胞仍可保持正常状态。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞无血清培养基
本专利技术涉及细胞培养的
，尤其是一种间充质干细胞无血清培养基。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是中胚层来源的具有自我复制、多向分化和免疫调节功能的多能干细胞。MSC具有低免疫原性的特性，所以可以逃避T细胞的识别。此外MSC可抑制IL-2介导的NK细胞活化，从而达到免疫耐受，避免迟发性移植物宿主反应。MSC可通过分泌细胞因子，改变组织微环境，促进损伤修复。近年来，MSC在临床上得到了广泛的应用，在治疗白血病等恶性血液病、再生障碍性贫血、难治疗性免疫缺陷病、某些遗传性疾病以及组织器官损伤修复等多种疾病具备显著的疗效。干细胞的作用机制主要是通过抑制细胞死亡、促进细胞分化、增殖从而实现受损组织的修复。用于临床的间充质干细胞主要来自骨髓、脐带、脂肪和干细胞动员后的外周血。由于脐带为医疗废弃物，因此来源丰富取材方便。且对供者无不利影响，无伦理问题的限制。脐带中的间充质干细胞含量丰富，未分化程度高，因此分化能力强且更利于在体外培养扩增，可为实验和临床提供充足的细胞来源。间充质干细胞在组织中的含量极低，给干细胞研究和应用带来了限制。如何获得大量高纯度和高活性的间充质干细胞，是相当重要的课题。国际干细胞治疗学会提出了鉴定人源间充质干细胞3条标准：1)在标准培养条件下间充质干细胞具备对塑料底物的贴附性；2)间充质干细胞群体表达CD105、CD73及CD90，而不表达造血标志物CD45和CD34；3)经体外诱导间充质干细胞能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。根据干细胞的这些特性，分离纯化以及培养扩增间充质干细胞。目前国内外并没有一个得到公认的、方便实用的间充质干细胞的培养方法。大多数仍采用添加胎牛血清(FBS)的培养基进行间充质干细胞培养。但是这种添加的异种血清可能会携带细菌、病毒等，存在着诸多安全隐患。异种血清带来的异源性蛋白，容易引起人体的过敏反应。有研究表明，MSC在体外培养过程中会吞噬培养基中的蛋白，因此含有胎牛血清的培养基，可使MSC细胞中含有牛血清蛋白，会使受者引起免疫反应。这些问题的存在，使人们限制了使用血清等添加物来培养间充质干细胞在临床中的应用。为解决培养基中的动物源性成分，有研究采用人血清、脐血清、富血小板血浆、血小板裂解液等来替代胎牛血清。这些动物血清替代物的主要作用是给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，虽然避免了动物性异源蛋白引入间充质干细胞。但是这些替代物同样存在一些缺点：首先是这些替代物成分不明确、血液制品具有批间差异，不稳定，且受供者年龄等影响；其次是血液制品也存在传染病和未知疾病检的潜在风险；另外人血液来源有限，限制了大规模间充质干细胞培养制备，不利于实际临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞无血清培养基，旨在解决现有技术中缺乏一种便于大规模培养制备间充质干细胞的培养基的问题。本专利技术是这样实现的，一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。进一步地，所述氨基酸包括L-酪氨酸(40mg/L)、L-胱氨酸(20mg/L)、甘氨酸(10mg/L)、L-缬氨酸(70mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-苯丙氨酸(50mg/L)、L-丝氨酸(50mg/L)、L-苏氨酸(75mg/L)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(500mg/L)和L-甘氨酰-L-谷氨酰胺(500mg/L)。进一步地，所述缓冲剂包括L-磷酸甘油二钠盐水合物(1.5g/L)以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1.2g/L)。进一步地，所述白蛋白的浓度为：2g/L。进一步地，所述其他蛋白为HoloTransferrin(人全铁转铁蛋白)。进一步地，所述营养因子包括Cholesterol(胆固醇)、EGF以及bFGF。进一步地，所述HoloTransferrin(人全铁转铁蛋白)的浓度为2-8mg/L。进一步地，所述Cholesterol(胆固醇)的浓度为0.05-0.2mg/L，所述EGF的浓度为0.001mg/L，所述bFGF的浓度为0.001mg/L。进一步地，所述基础培养基为DMEM。与现有技术相比，本专利技术提供的一种间充质干细胞无血清培养基，具有以下优点：(1)、无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。在无血清培养基中添加了特定的营养因子，提高了细胞扩增效率并保持了干细胞的生物特性，增加了间充质干细胞的活率，确保了细胞的质量达到临床应用标准。(2)、市场上现有的以LONZA为代表的无血清培养基，主要被国外公司垄断，价格高，且经常会出现供货不及时的状况。而本专利技术配置的无血清培养基，在细胞培养效果上能达到进口水平，基础培养基来源充足不受市场影响，解决了这一问题。(3)、简化细胞分离步骤，组织消化后的细胞即可直接用于原代培养，并保证培养细胞的专一性。(4)、使用本专利技术的培养基，细胞保持良好的贴壁性，呈现出梭形的成纤维细胞形态，同时经多代培养后，细胞仍可保持正常状态；细胞生长曲线说明，细胞维持高扩增效率；细胞免疫表型分析说明，CD29、CD73、CD90和CD105阳性表达物达95％以上；而CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR等阴性表达物检测显示在2％以下，达到临床应用水平。附图说明图1是本专利技术实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞形态观测结果图；图2是本专利技术实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞的生长曲线图；图3是本专利技术实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞的细胞免疫检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本专利技术的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。以下结合具体实施例对本专利技术的实现进行详细的描述。参照图1-3所示，为本专利技术提供较佳实施例。本专利技术提供了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基包括基础培养基和添加物。基础培养基为DMEM，添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。氨基酸包括L-酪氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。缓冲剂包括L-磷酸甘油二钠盐水合物以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸。其他蛋白包括HoloTransferrin(人全铁转铁蛋白)，营养因子包括Cholesterol(胆固醇)、EGF以及bFGF。这些添加物的优选浓度为：HoloTransferrin2-8mg/L、Cholesterol0.05-0.2mg/L、EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。2.如权利要求1所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸包括L-酪氨酸(40mg/L)、L-胱氨酸(20mg/L)、甘氨酸(10mg/L)、L-缬氨酸(70mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-苯丙氨酸(50mg/L)、L-丝氨酸(50mg/L)、L-苏氨酸(75mg/L)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(500mg/L)和L-甘氨酰-L-谷氨酰胺(500mg/L)。3.如权利要求2所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述缓冲剂包括L-磷酸甘油二钠盐水合物(1.5g/L)以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1.2g/L)。4.如权利要求3所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔兴日，吴俊昌，苏城昌，张捷，
申请(专利权)人：深圳市一五零生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44