一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基，这种培养基以EGM‑2作为基础培养基的条件下，在原有20％胎牛血清的基础上，将血清浓度降低到2％，再在培养基中添加5‑10g/L的大豆植物水解蛋白，10‑50μg/L的VEGF，2‑10μg/L的bFGF，20‑100μg/L的表皮生长因子，50‑200μM的维生素C，1‑5μM的CHIR98014；本发明专利技术研制的低血清培养基与常规培养基的20％胎牛血清相比形态相似，减少了污染，有利于细胞下游产品的分离、安全性好；与商用的培养基相比，降低了成本，适用于批量生产内皮祖细胞；本发明专利技术研制的低血清培养基增加了CHIR98014成分，CHIR98014与其他相同标准的GSKi相比能增加内皮祖细胞(EPCs)达到5倍量。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基
本专利技术涉及细胞低血清培养
，具体涉及一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基，用于内皮祖细胞的低血清培养及增殖。
技术介绍
冠状动脉疾病是心血管疾病中最常见的疾病，也是死亡率和发病率较高的疾病，其主要原因是动脉粥样硬化导致的血管狭窄。治疗冠状动脉疾病最常用的方法是利用球囊打开血管狭窄，然后永久性放置金属支撑材料，即众所周知的支架。裸金属支架的作用仅在于保持血管开放；而药物涂层支架不仅能保持血管开放，其药物涂层还能缓慢释放，帮助预防血管在手术后发生再狭窄或再次阻塞。但冠状动脉支架置入术后再狭窄及支架内远期血栓一直是困扰冠脉介入治疗疗效的首要问题，是介入心脏病学研究的热点和难点。目前临床应用的药物涂层支架较裸支架时代大大降低了再狭窄的发生,但由于其所载的药物主要为抑制细胞增生的药物，这些药物临床多数应用于肿瘤的治疗。无论从第一代药物涂层支架所担载的药物如雷帕霉素、紫杉醇，发展至现在新型药物涂层支架的药物如佐他莫司、依罗莫司，包括正在研发的三氧化二砷涂层支架，所有的药物主要作用机制是抑制细胞增殖来防止再狭窄，这些药物都是非平滑肌细胞选择性药物,在阻止平滑肌细胞增生的同时也阻止血管内皮细胞增生,使支架被内皮细胞覆盖时间过长或难以被覆盖，支架的暴露刺激内膜过度增生及平滑肌迁移。大多数支架内有不同程度的新生血管内膜组织增生。血管内膜是血管壁的最内层，是由血管内皮细胞及血管内皮下的血管平滑肌细胞所构成，故有再狭窄的发生。另外由于阻止平滑肌的生长,会使血管壁薄弱而产生动脉瘤,这种情况在支架移位时尤其严重。药物代谢衰减后可能存在反跳,如果出现则会造成平滑肌细胞反应性剧烈增生。较长病变可能涉及支架重叠放置,而重叠部分的药物浓度可能引起毒性反应。此外，在支架置入动脉部分可观察到不同程度的慢性炎症从而刺激内膜增生导致再狭窄。故研发一种既能降低再狭窄又能降低支架内血栓的新型支架迫在眉睫。血管再内皮化是解决上述问题的关键。这个领域一直是介入心脏病学工作者和公司研究的热点，具有重要的社会意义和经济意义。事实上，支架置入后动脉修复反应是复杂的。而血管再内皮化过程可能是由于：ⅰ)内皮细胞从邻近的动脉片段增殖和迁移；ⅱ)循环血液中的内皮祖细胞粘附、分化。事实上，几种不同的方法都可用于加速经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后的血管再内皮化(如：从直接将细胞种植在支架上到通过应用血管生长因子等如VEGF。最近大量研究报道更新了我们对血管新生内膜形成的理解，血管新生内膜不仅可以从血管壁形成还可以由血液循环中前体细胞群形成，例如内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)。加拿大渥太华心脏中心EdwardO’Brein实验室的动物模型证明了形成支架新内膜的大约80％细胞是来自血液循环而不是血管壁。加速内皮修复的手段均集中到通过各种方法捕获血液中内皮祖细胞在支架表面聚集，定向分化为内皮细胞，从而加速支架表面内皮化。基于大量的基础研究表明下一代的冠脉支架为加速内皮化支架。增加生物支架对内皮祖细胞的捕获能力及支架载体的相容性，同时抑制平滑肌细胞的增生，是支架未来发展方向的重中之中。增加支架对内皮祖细胞的捕获能力，目前可通过如下三种途径获得：(1)增加支架REDV浓度,提高其捕获内皮祖细胞能力；(2)提高内皮祖细胞内皮化能力。(3)增加循环中的内皮祖细胞数量。研究发现GSKi(糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的一种抑制剂)能够改善内皮祖细胞介导血动脉的修复。GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，通过失活糖原合成酶，能够负性调节WNT信号通路。GSKi在体内能调节前体细胞和造血干细胞的增殖，亦能够在局部缺血条件下提高内皮祖细胞功能而加强血管再生。因此，GSKi是能够提高血管损伤后的内皮祖细胞数量和功能，进而会促进动脉血管内皮修复。但是，与正常人相比，冠心病病人的内皮祖细胞不仅数量少而且功能也受损。对于冠心病病人，体外扩增和向体内移植内皮祖细胞(EPCs)是促进新血管形成的一条治疗新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服内皮细胞专用培养基EGM-2中必须使用高含量胎牛血清(fetalcalfserum，简称FBS)才能促进内皮祖细胞生长的缺点，提供一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基。这种培养基在EGM-2(购自美国LONZA公司)作为基础培养基的条件下，在原有20％胎牛血清的基础上，将血清浓度降低到2％，再在培养基中添加5-10g/L的大豆植物水解蛋白，10-50μg/L的VEGF，2-10μg/L的bFGF，20-100μg/L的表皮生长因子，50-200μM的维生素C，1-5μM的CHIR98014。与通过引入动物来源组分降低血清用量的培养方法相比，本专利技术研制的低血清培养基，引入的是植物源的蛋白质-大豆植物水解蛋白，重组表皮生长因子和一些化学合成物质。大豆植物水解蛋白是一种超滤、不含动物组分培养基添加物，它是由高度优化的过程生产而来的，在生产中使用了独特的混合酶，含有多种氨基酸成分。重组表皮生长因子和其他添加成分的来源明确，成分均一。本专利技术研制的低血清培养基与常规培养的20％胎牛血清相比形态相似，减少了污染，有利于细胞下游产品的分离、安全性好；与商用的培养基相比，降低了成本，适用于批量生产内皮祖细胞。本专利技术研制的低血清培养基增加了CHIR98014成分，CHIR98014与其他相同标准的GSKi相比能增加内皮祖细胞(EPCs)达到5倍量。附图说明图1是本专利技术实施例二中与20％胎牛血清比较的内皮祖细胞培养72小时图片。图2是本专利技术实施例二中与2％胎牛血清比较的内皮祖细胞培养72小时图片。具体实施方式实施例一：本实施例用EGM-2作为基础培养基的条件下，使用2％胎牛血清，5g/L的大豆植物水解蛋白，10μg/L的VEGF，2μg/L的bFGF，20μg/L的表皮生长因子，50μM的维生素C，1μM的CHIR98014。本实施方式降低了常规培养基使用的胎牛血清的量，采用大豆植物水解蛋白，其成本低于常规培养基，解决了因降低胎牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱和的问题，使用CHIR98014扩增了内皮祖细胞的数量。实施例二：本实施例用EGM-2作为基础培养基的条件下，使用2％胎牛血清，再在培养基中添加10g/L的大豆植物水解蛋白，50μg/L的VEGF，10μg/L的bFGF，100μg/L的表皮生长因子，200μM的维生素C，5μM的CHIR98014。本实施方式降低了常规培养基使用的胎牛血清的量，采用大豆植物水解蛋白，其成本低于常规培养基，解决了因降低胎牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱和的问题，使用CHIR98014扩增内皮祖细胞数量。实施例三：本实施例用EGM-2作为基础培养基的条件下，使用2％胎牛血清，再在培养基中添加7g/L的大豆植物水解蛋白，30μg/L的VEGF，7μg/L的bFGF，70μg/L的表皮生长因子，100μM的维生素C，3μM的CHIR98014。本实施方式降低了常规培养基使用的胎牛血清的量，采用大豆植物水解蛋白，其成本低于常规培养基，解决了因降低胎牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱和的问题，使用CHIR98014扩增内皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基，其特征在于以EGM‑2作为基础培养基，在基础培养基中加入2％的胎牛血清，然后在培养基中添加5‑10g/L的大豆植物水解蛋白，10‑50μg/L的VEGF，2‑10μg/L的bFGF，20‑100μg/L的表皮生长因子，50‑200μM的维生素C，1‑5μM的CHIR98014。

【技术特征摘要】
1.一种扩增内皮祖细胞数量的低血清培养基，其特征在于以EGM-2作为基础培养基，在基础培养基中加入2％的胎牛血清，然后在培养基中添加5-10g/L的大豆植物水解...

【专利技术属性】
技术研发人员：张基昌，石旭东，刘永利，张明，刘斌，郭子源，赵卓，刘一航，吴熙，张建奇，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22