一种细菌纤维素高产菌株的构建方法技术

技术编号:20088999 阅读:34 留言:0更新日期:2019-01-15 08:07
本发明专利技术公开了一种细菌纤维素高产菌株的构建方法。即通过同源重组的方法敲除木葡萄糖醋酸杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因,并通过外源引入FLP蛋白表达途径消除抗性标记基因。本发明专利技术还公开了利用所述方法构建的细菌纤维素高产菌株和利用该菌株生产细菌纤维素的方法。利用本发明专利技术的菌株可显著地提高细菌纤维素的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌纤维素高产菌株的构建方法
本专利技术涉及基因工程和发酵工程领域。确切的说,本专利技术涉及细菌纤维素的高产菌株及其制备方法。
技术介绍
近年来,细菌纤维素由于其高纯度,以及优良的性质如高亲水性、高生物相容性以及良好的机械性能被广泛应用于各个行业,如生物医药行业中的伤口辅料,造纸行业中纸张的改性,以及食品行业。木葡萄糖醋酸杆菌合成细菌纤维素有直接和非直接两种合成途径,其中非直接合成途径通过磷酸戊糖途径和糖异生途径合成细菌纤维素,在直接合成途径中己糖磷酸盐通过异构化和磷酸化,直接合成细菌纤维素。其中的4个主要酶促反应步骤:(1)葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下合成6-磷酸葡萄糖;(2)6-磷酸葡萄糖在变位酶的作用下转变成1-磷酸葡萄糖;(3)1-磷酸葡萄糖在UDPG焦磷酸化酶的作用下转化为尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG);(4)UDPG在纤维素合成酶的作用下转化为β-1,4-葡萄糖苷链,再装配成细菌纤维素。在木葡萄糖醋酸杆菌的代谢初期,约有95%葡萄糖将通过葡萄糖脱氢酶转化成葡萄糖酸。因此通过基因工程的手段将葡萄糖生成葡萄糖酸的代谢途径切除将有效地提高木葡萄糖醋酸杆菌的菌体量和细菌纤维素产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种细菌纤维素高产菌株的构建方法并利用这一构建方法构建得到细菌纤维素高产菌株。为实现上述目的,本专利技术采用了以下构建方案:一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,包括以下步骤:(1)葡萄糖脱氢酶编码基因的敲除:利用同源重组的方法对木葡萄糖醋酸杆菌目的基因进行基因敲除。(2)敲除子的筛选:通过氨苄平板对敲除子进行筛选。(3)氨苄抗性的消除:外源导入FLP合成系统对抗性标记进行消除。(4)发酵培养:重组菌株发酵培养及产量的测定。根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,步骤(1)目的基因为葡萄糖脱氢酶编码基因。根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,步骤(2)氨苄平板为加入了氨苄青霉素的固体木醋培养基。根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,步骤(3)FLP合成系统是指通过ITPG诱导表达flp基因,抗性标记是指在基因重组过程中的氨苄抗性基因。根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,步骤(4)发酵培养过程所用到的培养基是木醋培养基:葡萄糖25g/L蛋白胨10g/Lyeast7.5g/LNa2HPO410g/L。本专利技术的的积极意义1.本专利技术提供了一种细菌纤维素高产菌株的构建方法以及一种有效消除标记基因的方法。2.本专利技术通过基因工程的手段,定向的编辑合成细菌纤维素过程中的关键基因,有效的提高了细菌纤维素的产量以及葡萄糖的利用率3.本专利技术为其他细菌或真菌的代谢调控和基因编辑过程提供了方法。附图说明图1是构建的敲除质粒具体实施方式通过具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明。本专利技术关键在于提供一种细菌纤维素高产菌株的构建方法。利用这一方法有效的对木葡萄糖醋酸杆菌中细菌纤维素合成过程中的关键基因进行基因编辑,有效的提高了细菌纤维素的产量。具体方式实施如下实施案例1菌种的培养木醋培养基葡萄糖25g/L蛋白胨10g/Lyeast7.5g/LNa2HPO410g/LpH6.0。LB培养基蛋白胨10g/Lyeast5g/LNaCl10g/LpH7.0。木醋固体培养基在木醋培养基中加入2%的琼脂粉LB固体培养基在LB培养基中加入2%的琼脂粉大肠杆菌的培养条件是37℃200r/m木葡萄糖醋酸杆菌的培养条件是30℃200r/m实施案例2大肠杆菌感受态细胞的制备(1)挑取一环新鲜的大肠杆菌单菌落接种于装有25mLLB液体培养基的100mL三角瓶中,180r/min、37℃振荡培养过夜。(2)取1mL培养的种子液接种于装有100mLLB液体培养基的500mL三角瓶中,180r/min、37℃振荡培养至OD600=0.4-0.5。(3)将菌液分装至两个50mL离心管中,冰浴30min,4℃,4000r/min离心10min,弃上清。(4)向离心管中加入10mL预冷的氯化钙溶液悬浮菌体沉淀,冰浴30min,4℃,4000r/min离心10min,弃上清。(5)向离心管中加入10mL预冷的氯化钙溶液重新悬浮菌体沉淀,4℃,4000r/min离心10min,弃上清。向离心管中加入5mL预冷的氯化钙-甘油溶液,重新悬浮菌体沉淀,每100μL分装于1.5mL灭菌的EP管中,即为感受态细胞。木葡萄糖醋酸杆菌感受态细胞的制备(1)从4℃保存的斜面上挑取菌落划线接种到新鲜平板上,30℃培养24-48h,至可辨别单菌落。(2)挑取一个单菌落接入装有25mL液体培养基的100mL三角瓶中,30℃,180r/min培养15-16h。(3)取1mL预培养的菌液接入装有200mL液体培养基的500mL三角瓶中,加入4%纤维素酶,30℃,180r/min培养24h,使得OD610=0.6-0.8。(4)装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15min。(5)取一定量菌液至预冷的50mL离心管中,4℃下4000r/min离心10min,去上清。(6)加入预冷却的1mMHEPES溶液重悬菌体(可反复吹打),使菌液充分扩散。(7)于4℃,4000r/min离心10min,去上清,重复用HEPES溶液洗涤两次。(8)加入一定量预冷的10%甘油溶液(菌体最终浓缩100倍),摇匀,置于冰浴中。(9)分装于已灭菌的Ep管中,每管100μL,用于电转化实验,置于-80℃保存备用。实施案例3将敲除质粒通过电转化的方法导入至木葡萄糖醋酸杆菌进中。电转条件为电转过后孵育、图板进行敲除子的筛选。选出敲除子过后,诱导表达FLP蛋白进行抗性基因的消除。实施案例4将案例3中获得的菌株进行摇瓶发酵培养,培养时间为10d,在此期间每天进行取样。实施案例5细菌纤维素的处理过程:将细菌纤维素利用0.1M的NaOH进行浸泡,每天换液。当细菌纤维素泡白时,利用蒸馏水进行浸泡,每天换液,直至pH为7.将浸泡处理的膜取出进行压膜处理,放入80℃恒温箱烘干至恒重,称量。以上实施例的说明只是用于帮助理解本专利技术的方法及其核心思想。应当指出,对于本
的普通技术人员来说,在不脱离本专利技术原理的前提下,还可以对本专利技术进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本专利技术权利要求的保护范围内。本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,其特征在于,所述方法为:(1)葡萄糖脱氢酶编码基因的敲除:利用同源重组的方法对木葡萄糖醋酸杆菌目的基因进行基因敲除。(2)敲除子的筛选:通过氨苄平板对敲除子进行筛选。(3)氨苄抗性的消除:外源导入FLP合成系统对抗性标记进行消除。(4)发酵培养:重组菌株发酵培养及产量的测定。

【技术特征摘要】
1.一种细菌纤维素高产菌株的构建方法,其特征在于,所述方法为:(1)葡萄糖脱氢酶编码基因的敲除:利用同源重组的方法对木葡萄糖醋酸杆菌目的基因进行基因敲除。(2)敲除子的筛选:通过氨苄平板对敲除子进行筛选。(3)氨苄抗性的消除:外源导入FLP合成系统对抗性标记进行消除。(4)发酵培养:重组菌株发酵培养及产量的测定。2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,消除或减弱葡萄糖酸合成能力是指葡萄糖酸合成过程中所涉及到的葡萄糖脱氢酶的活性部分或完全缺失。3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述方法还包括增强细菌纤维素生产菌株中细菌纤维素合成途径以及异源表达生产细菌纤维素...

【专利技术属性】
技术研发人员:钟成尤勇贾士儒
申请(专利权)人:天津科技大学
类型:发明
国别省市:天津,12

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