一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域的一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。所述表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的。本发明专利技术中所构建的工程菌，采用重组红球菌作为宿主菌，相比于重组大肠杆菌，其表达的环氧化物水解酶的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物耐受性/产物耐受性都有明显的优势。利用本发明专利技术中的工程菌用于催化生产光学纯(R)‑ECH，相比于采用相同游离酶进行的催化，(R)‑ECH的浓度提高了46％，收率提高了31％。相对于游离酶或者重组大肠杆菌，重组红球菌的综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
环氧化物水解酶(Epoxidehydrolases)是一类重要的工业酶，可选择性催化水解外消旋环氧化物而得到手性环氧化物和相应的邻位二醇，在医药、农药和香料等方面有广阔的应用前景。环氧化物水解酶广泛存在于细菌、真菌、动物、植物中，其催化过程不需要金属离子或者辅酶参与，具有底物谱宽、催化效率高、对映体选择性高等优点。手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的手性合成砌块，在医药、农药、精细化工等领域有广泛的应用，比如，(R)-ECH是合成治疗心绞痛类药物(如美托洛尔、阿普洛尔)的关键手性中间体，(S)-ECH是他汀类药物的起始原料之一。目前已有很多研究者利用环氧化物水解酶拆分制备手性环氧氯丙烷。Choi等利用黑曲霉(Aspergillusniger)在环己烷-水(体积比为98:2)的两相体系中拆分(S)-ECH，底物浓度60mM，ee值大于99％，收率20％(Choi,etal.,1999,JBiosciBioeng,88:339-341)。Lee等使用毕赤酵母(Pichiapastoris)重组表达来自胶红酵母(Rhodotorulaglutinis)的环氧化物水解酶制备(R)-ECH，底物浓度50mM，ee值100％，收率26％(Lee,etal.,2004,BiotechnologyandBioprocessEngineering,9:62-64)。Woo等利用来源于海洋新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的环氧化物水解酶制备(S)-ECH，ECH浓度500mM，ee值大于99％，收率20.7％(Woo,etal.,2010,JournalofBioscienceandBioengineering,110:295-297)。由于产环氧化物水解酶野生菌的活性、对映体选择性和稳定性等问题，反应的底物浓度或者收率通常较低，在一定程度上限制了环氧化物水解酶的工业应用，因此环氧化物水解酶的重组表达和分子改造受到很多研究者的关注。格罗宁根大学对来自放射形农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)的环氧化物水解酶进行克隆表达和突变改造，使其对多种底物的对映体选择性大幅提高(EP879890-A1；EP1013768-A1；Van,etal.,2004,CHEMISTRY&BIOLOGY,11:981-990)。浙江工业大学将该酶在大肠杆菌中进行克隆表达和定向进化，用于拆分环氧氯丙烷制备(R)-ECH，其活性、对映体选择性和热稳定性均有所提高(Jin,etal.,2013,ENGINEERINGINLIFESCIENCES,13:385-392；CN105734028A)。虽然环氧化物水解酶已被广泛应用，但为了适应工业催化过程的需求，其稳定性仍有待提高(包括热稳定性、pH稳定性、底物/产物耐受性等)。红球菌是一种革兰氏阳性菌，在生物转化、生物降解和生物表面活性剂等方面有重要的应用，具有很高的商业价值。红球菌已广泛应用于丙烯酰胺、丙烯酸、羟基乙酸和烟酰胺等化学品的生产，在工业生物催化过程中表现出优越的稳定性，包括热稳定性和对有毒化合物的耐受性。清华大学化工系首次利用重组红球菌高表达外源腈水解酶，获得了高腈水解酶活性及高丙烯酸(铵)合成效率(Sunetal.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology.2016,43(12):1631-1639；于慧敏等，双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用，中国专利技术专利，CN105420154A)。为了解决环氧化物水解酶催化生产手性环氧氯丙烷过程中的底物/产物耐受性差、底物浓度不高、拆分效率低等问题，急需开发新的工程菌进行环氧化物水解酶性能的提高。
技术实现思路
为了解决现有技术中环氧化物水解酶催化生产手性环氧氯丙烷过程中的底物/产物耐受性差、底物浓度不高、拆分效率低等问题，本专利技术提供一种表达环氧化物水解酶的工程菌，其可以生产特定来源的环氧化物水解酶，实现高表达及高稳定性水相催化，从而实现手性环氧氯丙烷的高效制备。所述表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌(Rhodococcusruber)而得到的。上述工程菌中，所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌(AgrobacteriumradiobacterAD1)。上述工程菌中，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。上述工程菌中，所述红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的红球菌。上述工程菌中，优选的，所述赤红球菌为RhodococcusruberTHdAdN(公开于中国专利文献CN105420154A)上述工程菌的构建方法，包括如下步骤：优化环氧化物水解酶基因并合成，将环氧化物水解酶基因接入质粒构建环氧化物水解酶的表达载体；将环氧化物水解酶的表达载体转化到赤红球菌中。上述构建方法中，所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌。上述构建方法中，优选的，所述环氧化物水解酶基因的核酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。上述构建方法中，所述红球菌为赤红球菌(Rhodococcusruber)，优选的，所述赤红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的赤红球菌。上述构建方法中，优选的，所述赤红球菌为RhodococcusruberTHdAdN(公开于中国专利文献CN105420154A)上述构建方法中，所述质粒为大肠杆菌-赤红球菌穿梭质粒或者pET28a。上述构建方法中，所述大肠杆菌-赤红球菌穿梭质粒为能够在大肠杆菌和红球菌中存活和复制。根据本专利技术的实施例，穿梭质粒为大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒，选自pNV18、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒中的一种。上述构建方法中，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒的启动子选自红球菌的酰胺酶启动子和红球菌的酰胺酶启动子的突变体中的一种。上述构建方法中，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒可以选择大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒pNV18.1-Pa2(公开于中国专利文献CN105420154A)。本专利技术还提供了上述工程菌在制备手性环氧氯丙烷中的应用。本专利技术也提供了一种制备手性环氧氯丙烷的方法，所述方法包括如下步骤：将包含上述工程菌的菌液加入反应器中，加入环氧氯丙烷，进行外消旋拆分。本专利技术的有益效果本专利技术中所构建的表达环氧化物水解酶的工程菌，采用重组红球菌作为宿主菌，相比于重组大肠杆菌，其表达的环氧化物水解酶的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物耐受性/产物耐受性都有明显的优势：工程菌(重组红球菌)的酶活达到5.4U/mL，比重组大肠杆菌高5倍；重组红球菌环氧化物水解酶的55℃半衰期是重组大肠杆菌的10倍；在pH＝12.0缓冲液中浸泡30min，重组红球菌的剩余酶活为75％，而重组大肠杆菌基本完全失活；256mMECH浸泡30min，重组红球菌的酶活没有损失，而重组大肠杆菌的剩余酶活只有26％。利用本专利技术中的工程菌用于催化生产光学纯(R)-ECH，在底物浓度为512mM，可得到182mM的(R)-ECH，ee本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的。

【技术特征摘要】
1.一种表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1-3任一项所述的工程菌，其特征在于，所述红球菌为赤红球菌，优选的，所述赤红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的赤红球菌。5.根据权利要求1-4任一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：优化环氧化物水解酶基因并合成，将环氧化物水解酶基因接入质粒构建环氧化物水解酶的表达载体；将环氧化物水解酶的表达载体转化到赤红球...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，梁有向，焦松，王苗苗，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11