本发明专利技术提供一种敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用，本发明专利技术通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌DW2的基因组内成功敲除碳代谢转录因子PhoP的基因—phoP，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本发明专利技术构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP的杆菌肽产量提高了15%以上。
【技术实现步骤摘要】
敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用
本专利技术涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性（GRAS）的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中。由于地衣芽胞杆菌遗传背景清晰，工业应用价值高等特点，因此其近年来被广泛研究。目前，地衣芽胞杆菌主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等生物化工产品。杆菌肽又名枯草菌素，是由12种氨基酸组成的一种不稳定多肽。其可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌，并与其它抗生素如青霉素、庆大霉素等具有协同效应。地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。转录因子PhoP是原核生物中广泛存在的全局性转录调控因子。现有研究结果表明，PhoP不仅可以直接调控磷代谢相关基因（phop、phoA、phoB、phoC、pstS、phoU、phoD等）的表达，其还对氮代谢转录因子及基因（glnR、ureA、nrgA、gltB、gltP、glnA、glnII）、细胞分化相关转录因子及基因（sigE、sigU、chpC、bldA、bldC、bldD、bldK、bldM）、磷壁酸合成相关基因（tauA、tagA和tagD）及抗生素（阿维菌素、匹马霉素、链霉素、土霉素、头孢菌素C等）的合成均具有调节作用。此外，细胞内的氧化磷酸化、硝酸盐呼吸、铁代谢、氧化应激、淀粉水解等途径相关基因也都受到PhoP的直接调控。地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种敲除碳代谢转录因子PhoP的基因—phoP的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法，成功得到缺失了phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株。敲除phoP的地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的构建方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；（2）通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；（3）采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；（4）准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔphoP；（6）将敲除质粒T2(2)-ΔphoP转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（8）挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了phoP基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP（简称：BacilluslicheniformisDW2ΔphoP）；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的phoP基因为SEQUENCELISTING中所示。本专利技术人通过构建敲除负责转录碳代谢转录因子PhoP的基因—phoP基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP，成功得到了缺失phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。本专利技术的目的之二在于根据上述敲除phoP的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP。本专利技术的目的之三在于上述地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。所述种子发酵的培养基配方为：8～10g/L蛋白胨，3～6g/L酵母浸出粉，7～10g/L氯化钠，pH7.0～7.2。所述生产发酵的培养基配方为：80～100g/L豆粕；15～40g/L玉米淀粉；4～8g/LCaCO3和0.5～2g/L(NH4)2SO4。与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本专利技术构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP的杆菌肽产量提高了15%以上。本专利技术的研究结果表明：敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA中的碳代谢转录因子基因phoP是一种十分有效的提高杆菌肽产量的方法。附图说明图1为步骤（1）得到的phoP基因上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为phoP基因上游同源臂，泳道3为phoP基因下游同源臂；图2为步骤（8）得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP菌株的验证条带，泳道1为为DNAmarker，泳道2为成功敲除phoP的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP菌株的验证条带，泳道3为野生菌株DW2的PCR验证条带；其中，上述DNAmarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式现根据附图具体阐述本专利技术的较佳实施方式：敲除phoP的地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的构建方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；（2）通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；（3）采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；（4）准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔphoP；（6）将敲除质粒T2(2)-ΔphoP转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（8）挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了phoP本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；（2）通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；（3）采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；（4）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒 T2(2)‑ori进行双酶切得到线性质粒片段；（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)‑ΔphoP；（6）将敲除质粒T2(2)‑ΔphoP转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（8）挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了phoP基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔphoP；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的phoP基因为SEQUENCE LISTING中所示。...
【技术特征摘要】
1.敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的构建方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；（2）通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；（3）采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；（4）准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔphoP；（6）将敲除质粒T2(2)-ΔphoP转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（8）挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，朱杉，朱江，李俊辉，陈晓斌，楼丽君，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35
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