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一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法技术

技术编号:20088996 阅读:59 留言:0更新日期:2019-01-15 08:07
本发明专利技术公开了一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法,属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术应用基因工程方法,敲除基因zwf、malE,替换谷氨酸棒杆菌基因icdCg为变形链球菌Streptococcus mutans JH 1005中基因icdSm,达到重组菌胞内NADPH水平精确调控的目的。重组菌经LBG液体培养基摇瓶实验,重组菌胞内NADH含量由出发菌的1.97μmol(g DCW)

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法
本专利技术涉及一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法,属于基因工程和酶工程

技术介绍
NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)又称为还原型辅酶Ⅱ,在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用,具有重要的生物学意义。它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物,NADPH在细胞内分布广泛,通过参与800多个氧化还原反应来调节细胞内氧化还原水平并影响着众多基因表达、细胞功能、代谢途径和物质跨膜运输,参与多种合成代谢反应,如参与合成代谢,如氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成均需NADPH提供还原力,对细胞正常生长和代谢有重要影响NADPH是NADP+的还原形式。并且是微生物代谢网络中含量最丰富的氧化还原辅酶之一。微生物细胞内NADPH主要通过中心碳代谢途径合成。其中,磷酸戊糖途径的不可逆氧化阶段是NADPH的主要来源。依赖NADP+的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在氧化生成1mol6-磷酸葡萄糖酸和氧化脱羧生成1mol5-磷酸核酮糖过程中,分别产生1molNADPH。微生物胞内NADPH的消耗主要通过同化作用。同化作用利用中心碳代谢途径的中间代谢物,合成75~100个细胞原件、辅酶以及辅基,维持细胞正常生长代谢。此过程需消耗大量ATP和NADPH,如合成1g大肠杆菌干细胞需消耗41molATP和18molNADPH。由此可见,胞内NADPH的生成和消耗同胞内很多重要的代谢途径相关联,维持细胞内辅酶的平衡对于细胞生长、代谢以及产物的合成都非常关键。为了维持细胞正常生长和代谢,必须精确调控细胞内NADPH的供应与需求。NADPH对C.glutamicumlysCfbr合成L-赖氨酸非常重要,合成1molL-赖氨酸需要消耗4molNADPH。在L-赖氨酸生物合成途径中有四个反应涉及NADPH的消耗。谷氨酸棒杆菌中NADPH的代谢调控机制在不同的生理条件下通过13C代谢流分析得以阐明,这为建立NADPH平衡具有重要作用。在谷氨酸棒杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、苹果酸酶和异柠檬酸脱氢酶以NADP+为辅因子,参与NADPH合成,这些NADPH不仅要满足L-赖氨酸合成需求而且还要用于菌体生长。因为,增加1g菌体需要消耗16.4mmolNADPH。谷氨酸棒杆菌中NADPH的代谢是非常灵活的,它的消耗与合成很大程度上取决于菌体生长状态、碳源的供应以及菌体的遗传背景。目前许多基于NADPH供给的调控策略无法调控和优化胞内NADPH与中心碳代谢的特异性,为满足L-赖氨酸高效合成时对NADPH的需求,理论上提高NADPH的供给水平可显著增加L-赖氨酸产量。但一味强调提高辅因子NADPH的合成量,不仅不利于L-赖氨酸的大量积累,还阻碍了菌体对糖的利用和降低菌体量,辅因子NADPH水平与胞内微环境、代谢网络和目标代谢产物合成之间的关系还不明确。
技术实现思路
为解决上述问题,本专利技术首次用来源于Streptococcusmutans中的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换C.glutamicumlysCfbr中的NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶并同时敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸酶编码基因,解决了不破坏三羧酸循环的情况下,阻断其NADPH的合成。本专利技术的目的是:阻断胞内NADPH的合成,实现菌株胞内NADPH水平的精确调控。本专利技术的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌,所述重组菌异源表达了NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶icdSm,并敲除了NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶icdCg、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf和苹果酸酶malE。在本专利技术的一种实施方式中,所述的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌Streptococcusmutans。在本专利技术的一种实施方式中,所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中,所述NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中,所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中,所述的苹果酸酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中,所述重组菌的宿主为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumlysCfbr。在本专利技术的一种实施方式中,所述重组菌以pK18mobsacB作为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法,包括如下步骤:(1)分别构建重组自杀型质粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm、pK18mobsacB-△zwf和pK18mobsacB-△malE;(2)重组菌株C.glutamicumlysCfbrΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm的构建:分别将步骤(1)的三种重组自杀型质粒转化到宿主谷氨酸棒杆菌C.glutamicumlysCfbr中,筛选得到所述的重组菌。本专利技术的第三个目的是提供重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。本专利技术的有益效果是:本专利技术通过利用菌株C.glutamicumlysCfbr(基因lysC编码酶AK解除反馈抑制作用)为出发菌株,该菌株为遗传背景清晰的L-赖氨酸产生菌,利用基因工程手段敲除参与胞内NADPH合成途径中的关键酶基因zwf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、malE(苹果酸酶),并将自身NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(编码基因icdCg)替换成StreptococcusmutansNAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(编码基因icdSm),获得基因工程菌株C.glutamicumlysCfbrΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm,重组菌经LBG液体培养基摇瓶实验,重组菌胞内NADH含量由出发菌的1.97μmol(gDCW)-1增加到2.73μmol(gDCW)-1,胞内NADPH含量降低至0.15μmol(gDCW)-1,明显低于出发菌胞内NADPH含量1.43μmol(gDCW)-1。此专利技术成功阻断了谷氨酸棒杆菌中NADPH合成的相关途径,可精确调控胞内NADPH水平的菌株提供崭新的思路。附图说明图1:谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸合成中NADPH的生成途径;注:编码基因:zwf葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,gnd6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,malE苹果酸酶;icd异柠檬酸脱氢酶。图2:验证基因zwf、malE敲除和基因icd替换PCR产物电泳图;泳道说明:M泳道为DNAMarker/Ladder;1号泳道为以C.glutamicumlysCfbrΔzwf基因组为模板,zwf-F和zwf-R为引物的PCR产物;2号泳道为以C.glutamicumlysCfbrΔzwfΔmalE基因组为模板,malE-F和malE-R为引物的PCR产物;3号泳道为以C.glutamicumlysCfbrΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm基因组为模板,icd-F和icd-R为引物的PCR产物;图3:重组菌和出发菌胞内腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP和AMP)的测定;图4:重组菌和出发菌胞内吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)的测定。具体实本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述重组菌异源表达了NAD+‑依赖型异柠檬酸脱氢酶icdSm,并敲除了NADP+‑依赖型异柠檬酸脱氢酶icdCg、葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶zwf和苹果酸酶malE。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述重组菌异源表达了NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶icdSm,并敲除了NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶icdCg、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf和苹果酸酶malE。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌Streptococcusmutans。3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。6.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌,其特征在于,所述的苹果酸酶...

【专利技术属性】
技术研发人员:徐建中杨汉昆张伟国于海波
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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