一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术以编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ(metal ABC transporter ATP‑binding protein)的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了9.4倍。

【技术实现步骤摘要】
一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用
本专利技术涉及一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程

技术介绍
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。但是，在乳酸菌的工业化发酵生产过程中，常常存在酸胁迫的问题。酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题，因此，急需找到一种新的效果优异、成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的可提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用。本专利技术以编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ(metalABCtransporterATP-bindingprotein)的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了9.4倍。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ(metalABCtransporterATP-bindingprotein)的基因；所述表达宿主为乳酸菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ来源于乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。本专利技术提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ来源于乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因与表达载体构建含有编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。本专利技术提供了利用上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述酸胁迫抗性提高的乳酸菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因；所述表达宿主为乳酸菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ来源于乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。本专利技术提供了上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。本专利技术提供了上述一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。有益效果：(1)本专利技术首次发现在乳酸菌中过量表达ZitQ蛋白可显著提高乳酸菌的酸胁迫抗性；(2)本专利技术通过在乳酸乳球菌中过量表达ZitQ蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000(pNZ8148/zitQ)；(3)利用本专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000(pNZ8148/zitQ)对酸胁迫的抗性较野生型有了明显的提高，其对乳酸的抗性较野生型提高了9.4倍。附图说明图1：重组质粒pNZ8148/zitP的结构图；图2：重组质粒pNZ8148/zitQ的结构图；图3：重组质粒pNZ8148/bglF的结构图；图4：重组质粒pNZ8148/ganP的结构图；图5：重组菌株LlactisNZ9000(pNZ8148/zitP)、LlactisNZ9000(pNZ8148/zitQ)和对照菌株的生长曲线；图6：重组菌株LlactisNZ9000(pNZ8148/bglF)、LlactisNZ9000(pNZ8148/ganP)和对照菌株的生长曲线；图7：pH4.0(乳酸调节)条件下重组菌株LlactisNZ9000(pNZ8148/zitP)与对照菌株的存活率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

【技术特征摘要】
1.一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因；所述表达宿主为乳酸菌。2.如权利要求1所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ来源于乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。3.如权利要求1或2所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，编码所述金属离子ABC转运ATP结合蛋白ZitQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求1-3任一所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148。5.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法为在乳酸菌中过量表达金属离子ABC转运ATP结合蛋白Zit...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，杨佩珊，陈坚，堵国成，王雅玲，张淑嫣，苗周迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32