本发明专利技术公开了一种可静态和动态调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的N端序列元件及应用，属于基因工程领域。本发明专利技术是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在目的蛋白编码基因前添加内源性蛋白N端编码前15个氨基酸的核酸序列，并在质粒中游离表达，使得枯草芽孢杆菌目的蛋白的表达实现在不同生长阶段的表达差异调控与表达量的调控。其中调控的类型包括：生长偶联型(等NHbs等)、迟滞表达型(NPdhD等)、持续表达型(NGlnA等)、强烈抑制型(NSat等)。同时，通过调控，使得目的蛋白相对表达量跨越四个数量级，为枯草芽孢杆菌目的蛋白高效表达和基因工程改造奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌表达蛋白中的应用
本专利技术涉及一种可静态和动态调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的N端序列元件及应用，属于基因工程领域。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是革兰氏阳性菌的代表，其不产生内毒素，是非致病的微生物，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证是安全的(Generallyrecognizedassafe，GRAS)食品级微生物。作为实验室中最常用的出发菌株，也作为在工业酶制剂生产、高附加产物的合成以及科学研究中广泛应用的菌株，枯草芽孢杆菌具有很多优势，包括：生长速度快，培养时间短，培养要求低；分泌信号肽的系统十分高效，使得其分泌蛋白能力强，这对后续蛋白提取工艺提供了很大便利；其分子伴侣系统十分高效，使得其在表达大部分真核来源的蛋白时，可以使得蛋白仍然保持其原有构象和活性。枯草芽孢杆菌的优势使得其在发酵行业应用十分广泛，其表达系统在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注,并有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达系统。然而，目前已开发的调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达的标准元件尚不完善。例如，启动子和终止子序列相对较长，增加了遗传操作的难度和DNA序列合成的成本。此外，大多数标准元件侧重于转录水平的调节，翻译水平调控工具和元件较少。同时，目前翻译水平的调控元件仅注重于调控目的基因的表达量，而没有发现其在动态调控中的作用。动态调节具有重要意义，可以最大限度地提高底物的利用效率，从而最大限度地提高代谢工程中高附加值产品的产量。因此，开发翻译水平上易于使用的动态控制工具也很重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌目的蛋白表达中的应用，是将具有调控功能的N端编码前15个氨基酸的特定核苷酸序列克隆并添加至目的蛋白的N端，构建到重组表达质粒中，再转化到枯草芽孢杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述特定核苷酸序列包括SEQIDNO.1～97中的任意一种。将这些N端序列元件按调控功能分为四类，包括生长偶联型(SEQIDNO.1～15，N端序列元件调控目的蛋白主要在稳定期之前表达)、迟滞表达型(SEQIDNO.16～17，N端序列元件调控目的蛋白主要在对数生长末期及稳定期表达)、持续表达型(SEQIDNO.17～90，N端序列元件调控目的蛋白的表达贯穿于细胞生长的所有时期)、强烈抑制型(SEQIDNO.91～97，N端序列元件调控目的蛋白表达被强烈抑制)。在本专利技术的一种实施方式中，所述目的蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)。在本专利技术的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体，将具有调控功能的N端序列连接在目的蛋白的N端，表达在枯草芽孢杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168。在本专利技术的一种实施方式中，所述pP43NMK已公开于ZhangXZ,CuiZL,HongQ,LiSP.High-levelexpressionandsecretionofmethylparathionhydrolaseinBacillussubtilisWB800.Appliedandenvironmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3中。本专利技术的第二个目的是提供一种调控目的蛋白表达的重组枯草芽孢杆菌，其表达如SEQIDNO.1～97所示的任一基因。本专利技术还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵使目的蛋白表达的方法，将37℃、750rpm、96孔深孔板中培养9h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入装有190μLLB培养基的96孔浅孔板，于37℃、750rpm条件下发酵4小时。本专利技术是以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为表达宿主，通过在目的蛋白编码基因前添加内源性蛋白N端编码前15个氨基酸的核酸序列，并在质粒中游离表达，使得枯草芽孢杆菌目的蛋白的表达实现在不同生长阶段的表达差异调控与表达量的调控。在不同生长阶段表达差异方面，我们将序列分成了四种类型：生长偶联型(NHbs等)、迟滞表达型(NPdhD等)、持续表达型(NGlnA等)、强烈抑制型(NSat等)。在表达量方面，提高蛋白表达量的N端序列中，蛋白表达量可提高约7倍；降低蛋白表达量的N端序列中，可降低至对照的0.011倍。这为枯草芽孢杆菌目的蛋白高效表达和基因工程改造奠定了基础。附图说明图1：添加如SEQIDNO.1所示的NHbs生长偶联型N端序列对蛋白表达的影响；图2：添加如SEQIDNO.17所示的NPdhD迟滞表达型N端序列对蛋白表达的影响；图3：添加如SEQIDNO.24所示的NGlnA持续表达型N端序列对蛋白表达的影响；图4：添加如SEQIDNO.92所示的NSat强烈抑制型N端序列对蛋白表达的影响。具体实施方式(一)重组枯草芽孢杆菌种子培养条件培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。培养条件：将37℃、750rpm、700μLLB培养基、96孔深孔板中培养9h的种子以5％的接种量转入190μLLB培养基，于37℃、750rpm条件下培养4h或20h。(二)绿色荧光蛋白表达量的测定方法在96孔板中每孔加入200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。实施例1重组质粒的构建重组质粒的组成是在Pp43NMK质粒的P43启动子之后按顺序依次插入如SEQIDNO.1～97所示的任一N端的序列(以GLNA蛋白的N端序列元件即SEQIDNO.24为例)、绿色荧光蛋白基因(序列如SEQIDNO.98所示)。为了将编码N端的序列引入P43启动子之后，设计引物rh_GLNA-0.75k_p43NMK-GFP_F(序列如SEQIDNO.99所示)、rh_GLNA-0.75k_p43NMK-GFP_R(序列如SEQIDNO.100所示)。以含有绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到绿色荧光蛋白片段；设计引物fx_GLNA-6.7k_p43NMK-GFP_F(序列如SEQIDNO.101所示)；fx_GLNA-6.7k_p43NMK-GFP_R(序列如SEQIDNO.102所示)，以质粒pP43NMK为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过GibsonAssemblyClongingKit(NewEnglandBiolabs)构建重组质粒，测序验证，确认重组pP43NMK-GLNA-GFP质粒构建成功。实施例2重组pP43NMK-GLNA-GFP质粒枯草芽孢杆菌的构建将构建好的pP43NMK-GLNA-GFP质粒转化枯草芽孢杆菌168野生型菌株。采用yz_zong-p43NMK_F(序列如SEQIDNO.103所示)及yz_zong-p43NMK_R(序列如SEQIDNO.104所示)引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1.8kb条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。实施例3添加N端序列对绿色荧光蛋白在工程菌中表达的影响将37℃、750rpm、700μLLB培养基、96孔深孔板中培养9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达目的蛋白中的应用，其特征在于，目的蛋白N端添加所述N端序列元件，使目的蛋白在枯草芽孢杆菌生长周期中的特定时期表达或抑制表达；所述N端序列元件是由特定核酸序列编码的氨基酸序列，包括生长偶联型、迟滞表达型、持续表达型、强烈抑制型这四种类型，根据目的蛋白的表达需求选择相应的N端序列元件；所述特定核酸序列包括SEQ ID NO.1～97中的任意一种。
【技术特征摘要】
1.一种N端序列元件在调控枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)表达目的蛋白中的应用，其特征在于，目的蛋白N端添加所述N端序列元件，使目的蛋白在枯草芽孢杆菌生长周期中的特定时期表达或抑制表达；所述N端序列元件是由特定核酸序列编码的氨基酸序列，包括生长偶联型、迟滞表达型、持续表达型、强烈抑制型这四种类型，根据目的蛋白的表达需求选择相应的N端序列元件；所述特定核酸序列包括SEQIDNO.1～97中的任意一种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N端序列元件按调控功能分为四种类型：(1)生长偶联型：N端序列元件调控目的蛋白主要在稳定期之前表达，其核酸序列如SEQIDNO.1～15任一所示；(2)迟滞表达型：N端序列元件调控目的蛋白主要在对数生长末期及稳定期表达；所述迟滞表达型N端序列元件的核酸序列如SEQIDNO.16～17任一所示；(3)持续表达型：N端序列元件调控目的蛋白的表达贯穿于细胞生长的所有时期；所述持续表达型N端序列元件的核酸序列如SEQIDNO.17～90任一所示；(4)强烈抑制型：N端序列元件调控目...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，堵国成，田荣臻，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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