一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，将两个降解相关的表达载体pRSFDuet‑nidA‑nidB和pCDFDuet‑fdr‑fdx共转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到工程大肠杆菌HY1，其中pRSFDuet‑nidA‑nidB表达载体插入了两段多环芳烃降解基因nidA和nidB；pCDFDuet‑fdr‑fdx表达载体插入了两段多环芳烃降解基因fdr和fdx。大肠杆菌工程菌表达了外源的降解基因，能够表达多环芳烃羟基化双加氧酶活性；提高了菌株对多环芳烃的降解能力。为以后多环芳烃污染物降解修复提供了新方法，为菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。

【技术实现步骤摘要】
一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于生物降解领域和基因工程领域。
技术介绍
随着煤和石油大量开采和广泛应用，其采集、精炼、运输、燃烧等过程产生的多环芳烃被大量累积。多环芳烃是指分子中含有2个或2个以上苯环的碳氢化合物，如萘、蒽、菲、芘、联苯、三联苯等。多环芳烃广泛存在于土壤、水体和空气中，水溶性差、具有热稳定性，而且其中相当的一部分都具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人类健康和生态环境造成了巨大危害，是环境中一类危险而需重点研究的化合物。生物法是利用生物体自身的生命活动来降解、利用这些污染物，并将其转化为结构简单无毒或低毒的物质，是一种成本低廉、无二次污染、修复彻底的环境修复技术。多环芳烃生物修复主要是指依靠微生物降解环境中的有毒有害污染物，并分解为无毒无害的CO2和H2O。但是自然环境中的多环芳烃野生降解菌对多环芳烃的降解率较低，因此考虑开展基因工程菌株的构建，将不同降解基因组合，构建出强化版工程菌株。构建基因工程菌可以解决单一降解菌应用的局限性及混合菌竞争抑制等问题，最重要的是可以大幅度提高对污染物的降解效率。重组基因技术的不断进步促进了基因工程的发展，以基因工程的思想改造菌种是一种达到定向目的的手段。虽然很多大肠杆菌(Escherichiacoli)本身并不能降解多环芳烃，但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌，其基因组和蛋白质组的信息比较全，代谢途径也比较清楚，而且一些大肠杆菌中存在多环芳烃降解基因，所以利用基因重组及其他分子生物学手段构建降解多环芳烃污染物的工程大肠杆菌是可行的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，使得大肠杆菌可以对多环芳烃污染物进行更高效率地降解。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌，其特征是将两个降解相关的表达载体pRSFDuet-nidA-nidB和pCDFDuet-fdr-fdx共转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中得到工程大肠杆菌HY1，其中pRSFDuet-nidA-nidB表达载体插入了两段多环芳烃降解基因nidA和nidB；pCDFDuet-fdr-fdx表达载体插入了两段多环芳烃降解基因fdr和fdx。作为优选，根据MycobacteriumvanbaaleniiPYR-1的降解基因nidA和nidB序列，根据AlcanivoraxborkumensisSK2的降解基因fdr和fdx序列，在金唯智生物科技有限公司进行针对E.coliBL21(DE3)的密码子优化，并合成nidA(如SEQIDNo.1所示核苷酸序列)和nidB(如SEQIDNo.2所示核苷酸序列)；fdr(如SEQIDNo.3所示核苷酸序列)和fdx(如SEQIDNo.4所示核苷酸序列)。原始底盘细胞为E.coliBL21(DE3)购买自北京全式金生物技术有限公司。pRSFDuet和pCDFDuet质粒购买自淼灵生物科技有限公司。本专利技术的降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌构建方法，包括以下步骤：(1)选择相容的质粒pRSFDuet和pCDFDuet为载体，首先降解基因根据大肠杆菌进行相应密码子优化并合成，再将降解基因nidA和降解基因nidB分别克隆至pRSFDuet载体的启动子下游，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pRSFDuet-nidA-nidB；将降解基因fdr和降解基因fdx分别克隆至pCDFDuet载体的启动子下游，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pCDFDuet-fdr-fdx；(2)利用大肠杆菌E.coliBL21(DE3)作为宿主，将重组载体pRSFDuet-nidA-nidB和pCDFDuet-fdr-fdx通过电击法或者热激法共转化，构建得到降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌HY1。本专利技术的基因工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用。具体说明如下：本专利技术提供了一种降解降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌株，该工程菌株包括大肠杆菌、共转入大肠杆菌的表达载体和参与多环芳烃降解过程的关键基因。作为优选，多环芳烃降解的关键基因为编码多环芳烃初步开环的羟基化双加氧酶的多个基因。所述基因工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用，所述应用方法如下：(1)将工程菌株活化后，将菌液接种到含有多环芳烃污染物的培养基中进行降解。(2)降解9-15天后，分析工程菌株对多环芳烃污染物的降解情况。本专利技术的优点表现为：大肠杆菌工程菌表达了外源的降解基因，构建的基因工程菌具有如下特性：能够表达较高的多环芳烃羟基化双加氧酶活性；外源基因的导入提高了菌株对多环芳烃的降解能力。这为以后多环芳烃污染物的降解修复提供了新方法，为菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。附图说明图1是重组载体pRSFDuet-nidA-nidB构建示意图；图2是重组载体pCDFDuet-fdr-fdx构建示意图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步说明：重组表达载体pRSFDuet-nidA-nidB构建过程如图1所示：①将合成得到的fdx所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，同样将pRSFDuet质粒使用FastDigest内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，酶切连接提质粒得到表达载体pRSFDuet-nidB；②将合成得到的nidA所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上NocⅠ和EcoRⅠ酶切位点，同样将pRSFDuet-nidB质粒使用FastDigest内切酶NocⅠ和EcoRⅠ进行酶切，酶切连接提质粒得到表达载体pRSFDuet-nidA-nidB。重组表达载体pCDFDuet-fdr-fdx的构建过程如图2所示：①将合成得到的fdx所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，同样将pCDFDuet质粒使用FastDigest内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，酶切连接提质粒得到表达载体pCDFDuet-fdx；②将合成得到的nidA所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上NocⅠ和EcoRⅠ酶切位点，同样将pCDFDuet-fdx质粒使用FastDigest内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，酶切连接提质粒得到表达载体pCDFDuet-fdr-fdx。实施例1重组表达载体pRSFDuet-nidA-nidB的构建(1)将合成得到的nidB，通过PCR方法在片段两端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，使用FastDigest内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，反应体系为：5μL10*FDbuffer，2.5μLNdeⅠ、2.5μLXhoⅠ、30μL加酶切位点的nidB所示核苷酸和10μL超纯水。反应条件为：37℃，1h。同样将pRSFDuet质粒使用FastDigest内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的SEQIDNo.2所示核苷酸和pRSFDuet质粒进行连接反应。反应体系为：1μL10*T4DNALigaseBuffer，1μLT4DNALigase，6μL酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降解多环芳烃污染物的基因工程菌，其特征是表达载体pRSFDuet‑nidA‑nidB和pCDFDuet‑fdr‑fdx通过在表达质粒pRSFDuet和pCDFDuet中插入编码多环芳烃初步开环的羟基化双加氧酶的多个基因构建得到，再将两个表达载体共转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到一种降解多环芳烃污染物的基因工程菌——工程大肠杆菌HY1。

【技术特征摘要】
1.一种降解多环芳烃污染物的基因工程菌，其特征是表达载体pRSFDuet-nidA-nidB和pCDFDuet-fdr-fdx通过在表达质粒pRSFDuet和pCDFDuet中插入编码多环芳烃初步开环的羟基化双加氧酶的多个基因构建得到，再将两个表达载体共转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中得到一种降解多环芳烃污染物的基因工程菌——工程大肠杆菌HY1。2.如权利要求1所述的工程菌，其特征是表达质粒pRSFDuet和pCDFDuet为相容性质粒。3.如权利要求1所述的工程菌，其特征是插入的降解基因具体为nidA、nidB、fdr、fdx。4.如权利要求1所述的工程菌，其特征是nidA为SEQIDNo.1所示核苷酸序列；nidB为SEQIDNo.2所示核苷酸序列；fdr为SEQIDNo.3所示核苷酸序列；fdx为SEQIDNo.4所示核苷酸序列。5.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，贺赟，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12