一种用于沂蒙黑山羊乳奶酪的凝乳酶及其生产菌株与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种专用于沂蒙黑山羊乳奶酪制作的凝乳酶及其生产菌株。所述菌株具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)X3菌株，保藏编号为CGMCC NO.14416。所述凝乳酶最适反应pH是7.2，在pH6.4‑7.6放置12h保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳酶活性大幅度下降；Ca

【技术实现步骤摘要】
一种用于沂蒙黑山羊乳奶酪的凝乳酶及其生产菌株与应用
：本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种专用于沂蒙黑山羊乳奶酪制作的凝乳酶及其生产菌株与应用。
技术介绍
：奶酪营养丰富、味道鲜美，储存期长且种类繁多。在奶酪的生产过程中，凝乳是影响奶酪产率和品质的关键性工艺。凝乳酶是制作奶酪过程中起凝乳作用的关键性酶，它是天冬氨酸蛋白酶中的一种，能够专一性裂解K-酪蛋白中的Phe105-Met106肽键，引起乳蛋白凝聚，在奶酪的加工中具有重要作用，同时凝乳酶对奶酪的品质和特有风味的形成起着非常重要的作用。小牛皱胃凝乳酶首次被发现并广泛应用于奶酪的加工领域，由于世界奶酪业的高速发展，使得小牛凝乳酶供应持续短缺，科学家不断寻找能够替代小牛皱胃口凝乳酶的蛋白酶。尽管研究人员发现了一些动物源的牛凝乳酶替代品(例如猪和鸡的胃蛋白酶)，但动物资源不如植物和微生物丰富。目前已经报道的植物来源凝乳酶主要为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等，而微生物来源的凝乳酶已有50多种，其中应用最多的是由微小毛霉产生的凝乳酶，该酶的蛋白分解能力比牛凝乳酶强，但比其它来源的蛋白酶弱。沂蒙山区特有的地理环境下所孕育的沂蒙山羊，其所产的沂蒙黑山羊乳中蛋白质及各种氨基酸的含量都高于牛乳，且其基本成分和各种营养元素配比均与人乳十分相近，营养丰富且易于吸收，是现代人类健康的营养佳品，经高科技脱膻处理后的山羊乳，口感香浓、细腻、滑爽，日益受到现代人的青睐。目前，未见文献或专利报道过具备沂蒙黑山羊乳特异性、并在pH7.0-7.3保持高活性的微生物凝乳酶，更没有明确这类蛋白质或其编码蛋白质的基因序列。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术将提供一种专用于沂蒙黑山羊乳奶酪制作的凝乳酶及其生产菌株与应用。本专利技术所述的凝乳酶，来自可高产凝乳酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3菌株。该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCCNO.14416；所述凝乳酶具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，该凝乳酶的编码基因具有SEQIDNO.1所示的核酸序列；所述凝乳酶具备沂蒙黑山羊乳特异性，可专用于生产沂蒙黑山羊乳奶酪，这里所说的特异性是指，当以不同哺乳动物奶液为底物时，菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3产生的凝乳酶对沂蒙黑山羊乳的凝乳活性最高，使沂蒙黑山羊乳最快凝固；所述凝乳酶的酶学性质如下：(1)所述凝乳酶最适反应pH是7.2，在pH6.4-7.6放置12h保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳酶活性大幅度下降；(2)Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Mn2+、Cu2+对该凝乳酶有抑制作用。有益效果：本专利技术提供的来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3的凝乳酶，具有沂蒙黑山羊乳特异性，可以加速沂蒙黑山羊乳的凝固，此外，该种凝乳酶在沂蒙黑山羊乳弱碱性环境下保持高凝乳酶活性，可专用于沂蒙黑山羊乳奶酪的制备，克服了传统凝乳酶不适宜沂蒙黑山羊乳乳酪生产的问题(传统的凝乳酶需要在酸性条件下发挥作用，沂蒙山黑羊乳的pH在中性)，在沂蒙黑山羊乳的深加工领域具备广泛的应用前景。附图说明：图1是凝乳酶的SDS-PAGE电泳分析，其中1-标准分子量蛋白，2-纯化后酶液；图2凝乳酶的最适反应pH；图3表示凝乳酶的pH稳定性；图4表示凝乳酶的最适反应温度。具体实施方式：以下通过具体实施例对本专利技术做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本专利技术实施范围的限定。实施例1地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3的培养及发酵液的制备菌株X3的摇瓶发酵在500mL三角瓶中进行，其中包含50mL的发酵培养基。发酵培养基由20g/L脱脂奶粉，5g/L蛋白胨，2g/L玉米浆，8g/L葡萄糖，4g/L氯化钠，3g/L磷酸氢二钠组成，初始pH7.0。上述培养基接种2mL的对数期种子液，37℃，200rpm培养。发酵结束后，发酵液离心10min，离心力4000g，上清液即为粗酶液。实施例2凝乳酶蛋白水解活性测定和凝乳活性测定(1)凝乳酶活性测定方法参照IDF的方法157A：1997；(2)蛋白水解活性测定方法参照改良的Lorry法。实施例3地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3所产凝乳酶的纯化程序将实施例1获得的粗酶液经过40％-65％乙醇沉淀后，12000rpm，离心30min获得的蛋白沉淀复溶于50mM的pH6.0的磷酸缓冲液中。上述复溶的酶液通过Watersproteinpaki-125分子筛层析柱(7.5×300mm)进一步分离纯化，上述层析柱预先用50mMpH6.0磷酸缓冲液(含0.15MNa2SO4)平衡。分离过程中，样品检测波长为OD280，流动相采用相同的缓冲液，流速1.0ml/min，每1.0mL洗脱液作为一个组分，分部收集。收集活性组分并通过AmiconUltra(Milipore)超滤浓缩及脱盐。最终，凝乳酶纯化倍数为9.2倍，回收率为15％，如表1所示。最终获得的酶浓缩液进行SDS-PAGE电泳分析，如图1所示，该凝乳酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳的分子量为52±1kDa，表1菌株X3所产凝乳酶的纯化结果纯化步骤总蛋白(mg)凝乳酶酶活(SU/mg)纯化倍数收率(％)粗酶液6.68501100乙醇40％-65％1.526003.0669.5分子筛层析0.178309.214注：蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定。实施例4最适反应pH取纯化后的凝乳酶液，用不同pH的磷酸盐缓冲液调节至不同的pH值，测定酶活力。以pH7.2，50℃为100％，计算相对酶活。结果如图2所示，本凝乳酶的最适反应pH为7.2。实施例5pH稳定性取纯化后的凝乳酶液，用不同pH的磷酸盐缓冲液调节至不同的pH值，常温放置12h。在pH7.0，50℃条件下为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，本凝乳酶在pH6.4-7.6的范围内稳定。实施例6最适反应温度取纯化后的凝乳酶液，在不同温度下测定酶活。以32℃条件下的酶活为100％，计算相对酶活力。结果如图4所示，本凝乳酶的最适反应温度为32℃。实施例7金属离子对凝乳酶活力的影响通过将10mM的单价离子(Na+，K+，Li+)，二价离子(Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Mg2+，Co2+)和三价离子(Al3+)加入到酶活测定反应混合液中，研究各种金属离子对BacilluslincheniformisX3凝乳活性的影响。未加入任何金属离子的反应液作为空白对照。如表2所示，Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Mn2+、Cu2+对该凝乳酶有抑制作用。表2金属离子对X3所产凝乳酶凝乳活性的影响金属离子浓度(mM)相对凝乳酶活性(％)空白-100K+10120.20±1.1Li+10100±0.2Na+10100±1.1Ca2+10123.25±1.3Mg2+10100±1.1Co2+1098.86±2.3Mn2+1045.10±2.6Fe2+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产凝乳酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)X3菌株，保藏编号为CGMCC NO.14416。

【技术特征摘要】
1.一种产凝乳酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)X3菌株，保藏编号为CGMCCNO.14416。2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌生产凝乳酶的方法，其特征在于，具体如下：将X3菌株种子液按4％的接种量...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，郭庆文，王克芬，刘文龙，张杰，佟新伟，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37