本发明专利技术涉及一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)ZJB‑17006及其应用，对催化N‑苯乙酰‑DL‑氨基酸生产L‑氨基酸对映体选择性值达到99％，对催化2‑N‑苯乙酰基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑DL‑丁酸制备2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑L‑丁酸对映体选择性值达到99％。
【技术实现步骤摘要】
纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006及其应用(一)
本专利技术涉及一株产酰胺水解酶的菌株——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)ZJB-17006，及其在催化N-苯乙酰基氨基酸制备手性氨基酸与催化氨基酸衍生物的N-苯乙酰基取代物制备手性氨基酸衍生物中的应用。(二)
技术介绍
L-草铵膦化学名称为：4-[羟基(甲基)膦酰基]-L-高丙氨酸，是L-谷氨酸的一种结构类似物，能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)活性，使植物体内氨积累，高浓度氨气积累阻断植物光呼吸作用，叶绿体结构的破坏以及基质的囊泡化，同时氨基酸合成受阻，导致细胞膜受损和细胞死亡，从而杀灭杂草。其具有广谱性，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。目前L-草铵膦合成方法有化学合成法和生物合成法。化学法主要通过以下4种方式构建L-草铵膦的手性中心：1)利用手性辅助试剂，手性诱导构建手性中心；2)以天然氨基酸为手性源，转化得到L-草铵膦；3)由手性催化剂催化的不对称合成反应；4)手性拆分外消旋体。但是化学法合成L-草铵膦工序多，收率较低，手性试剂成本高昂，且产生的三废量大，处理比较困难。生物法则具有严格的立体选择性，温和的反应条件、较高的收率和易于分离纯化等优势，因此，生物法生产L-草铵膦技术具有十分重要的产业化开发价值。生物法生产L-草铵膦根据作用底物不同有蛋白酶水解双丙氨膦、通过磷酸二酯酶I、酰胺酶I和谷氨酰胺酶分步协同作用保持光学活性水解L-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺、α-胰凝乳蛋白酶的拆分双丙氨膦乙酯、脱乙酰基酶拆分N-乙酰-草铵膦、酰胺酶拆分2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、酯水解酶水解L-草铵膦-N-羧酸酐、腈水合酶水解草铵膦含腈底物、转氨酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸等。目前合成L-草铵膦的化学方法主要有：1)手性辅助剂诱导法，以(S)-2-羟基-3-蒎酮为手性辅助剂制备，产率为51％，e.e.值为79％；以D-缬氨酸甲酯为手性辅助剂，需要-78℃低温反应，产率为51％，e.e.值为93.5％。2)天然氨基酸手性源法，以L谷氨酸为手性源，e.e.值为99.4％；L-蛋氨酸为手性源，总收率为42.3％，e.e.值为93.5％，需要用到剧毒碘甲烷。3)不对称合成法，不对称催化加氢——催化剂用量大且三甲基硅氰价格昂贵；不对称Strecker反应——用到剧毒氰化物；不对称Michael加成——催化剂用量大，且产品收率和e.e.值低。4)外消旋体拆分法，此方法最高收率86％，e.e.值最高99％，但拆分后D-草铵膦未转化，浪费原料。用酰胺水解酶选择性催化拆分2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，为实现工业化路线的L-草铵膦合成提供了依据。手性氨基酸及其衍生物在医药开发中的作用越来越大，目前的医药开发对手性纯度的要求越来越高。手性氨基酸生产工艺有化学拆分和酶法拆分等工艺。其中酶法拆分因为其条件温和，特异性强，污染小，较化学拆分有明显优势。其中酰胺水解酶选择性催化拆分N-苯乙酰基氨基酸生产手性氨基酸具有广阔的应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够产生酰胺水解酶的菌株——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)ZJB-17006，及其在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)制备L-草铵膦的重要有效成分L-氨基酸衍生物(2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)或催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸中的应用，为化学-酶法生产L-草铵膦有效成分及L-氨基酸提供了新的酶源，促进了绿色化学催化的发展。本专利技术采用的技术方案是：第一方面，本专利技术提供一株产酰胺水解酶菌株——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)ZJB-17006，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo：M2017601，保藏日期2017年10月23日，地址：中国.武汉.武汉大学，430072。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有催化合成L-草铵膦的能力。第二方面，本专利技术提供一种所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006在微生物催化拆分N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(优选2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)制备L-草铵膦的重要有效成分L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)中的应用，所述应用为：以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(优选2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成pH值为8.5的反应体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为10-200g/L，优选50g/L，所述底物初始加入终浓度为10-500mM，优选100mM。所述反应体系还可以由纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006经发酵培养获得的发酵液和底物构成，pH8.5；其中发酵液中湿菌体在整个反应体系中的终浓度10-200g/L，优选50g/L，底物在反应体系中的终浓度10-500mM，优选100mM。所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调pH至1.0-5.0(优选2.5)，以1-6.0Bv/h(优选4Bv/h)的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5M(优选1M)的氨水以0.5-3.0Bv/h(优选2Bv/h)进行洗脱，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸检测洗脱液，滤纸变紫表明洗脱液含有2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)。第三方面，本专利技术还提供一种所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸的应用，所述的应用以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成pH8.5的转化体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化，得到L-氨基酸。所述转化体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为20-300g/L(优选20-60g/L)，所述底物初始加入终浓度为50-500mM(优选100mM)。所述N-苯乙酰-DL-氨基酸为下列之一：N-苯乙酰-DL-丙氨酸、N-苯乙酰-DL-丝氨酸、N-苯乙酰-DL-谷氨酸、N-苯乙酰-DL-酪氨酸、N-苯乙酰-DL-苏氨酸、N-苯乙酰-DL-缬氨酸、N-苯乙酰-DL-天冬氨酸、N本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)ZJB‑17006，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2017601，保藏日期2017年10月23日，地址：中国·武汉·武汉大学，430072。
【技术特征摘要】
1.纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)ZJB-17006，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo：M2017601，保藏日期2017年10月23日，地址：中国·武汉·武汉大学，430072。2.一种权利要求1所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006在催化2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006经发酵培养获得湿菌体为催化剂，以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物，以缓冲液为反应介质构成pH8.5的反应体系，在25-55℃，100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为10-200g/L，底物初始加入终浓度为10-500mM。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调pH至1.0-5.0，以1-6.0Bv/h的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5M的氨水以0.5-3.0Bv/h进行洗脱，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。6.一种权利要求1所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZJB-17006经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸为底物，以缓冲液为反应介质构成pH8.5的转化体系，在25-55℃，100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，康雪梅，张晓健，金利群，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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