一种高通量选育石油降解突变株的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量选育石油降解突变株的方法，采用Licl‑ARTP复合诱变戈登氏菌株，提高菌株的石油烃降解能力。包括以下步骤：(1)菌悬液的制备(2)含不同浓度氯化锂的TSB固体培养基配制(3)对菌株分别进行单一化学诱变(Licl)和常温室压等离子体诱变(ARTP)，计算致死率并分别测定单一诱变菌株的石油烃降解率。(4)对菌株进行Licl‑ARTP复合诱变。(5)以96孔板发酵法代替摇瓶发酵法，采用紫外分光光度法高通量筛选诱变菌株。所述菌株为戈登氏菌。本方法诱变菌株正突变率高、石油烃降解能力明显提高。有利于工业应用，在经济、环境和社会效益方面都有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量选育石油降解突变株的方法
本专利技术属于微生物菌种的诱变选育
，涉及使用一种高通量选育石油降解突变株的方法，依据此方法可以选育获得高石油烃降解率的石油烃降解菌株。
技术介绍
石油是一种含有多种烃类(正烷烃、直链烷烃、芳烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类)的复杂化合物。石油含有多种有害物质，其中苯系物BTEX(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)和多环芳烃PAHs(菲、蒽、芘等)，具有显著的“三致”(致癌变、致突变、致畸)效应，采取有效措施进行驱油治理势在必行。采用戈登氏菌株降解石油是一种有效的方法，但目前主要问题是由于其降解效率低而导致降解成本高，变异频谱窄，变异率低，操作较复杂。化学诱变是用化学诱变剂诱发菌种遗传物质的突变，引起形态特征的变异，经鉴定、培育后，最终育成新品种。氯化锂作为一种高效、低毒的化学诱变剂，经常被用作诱变育种。氯化锂诱变可导致AT-GC碱基对的转换或导致碱基的缺失。常温室压等离子体诱变(ARTP)是近年来新兴的一种高效率诱变技术，以高纯氦气为工作气体，利用射频辉光放电原理，在常温常压状态下产生高能量的等离子体，其富含的高能化学活性粒子能够对菌株细胞产生高强度遗传物质损失，进而利用细胞启动的SOS高容错率修复机制，产生种类多样的错配位点，最终形成了遗传稳定、种类丰富的突变株。具有操作简便、条件温和、不需要真空条件、安全性高、诱变快速、突变率高等特点，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量提高菌株的变异几率。复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复使用和两种或多种诱变剂的同时使用。复合诱变具有协同效应，普遍认为两种或两种以上诱变剂合理搭配进行复合诱变较单一诱变效果好。紫外分光光度法测量石油烃降解率主要是根据石油及石油制品中的芳香族有机物及其他一些具有共轭双键有机物的紫外区能吸收光谱的特点，对石油类物质的含量进行测定测定范围为215-260nm。现阶段主要研究提高菌株石油烃降解能力的方法，主要以单一诱变方法为主。专利公开号CN101041811A公布了一种通过紫外诱变，驯化筛选石油烃降解菌株，该专利技术虽然提高了菌株的石油烃降解能力，但是负突变率高，筛选效率低。专利公开号CN103333881A公布了一种通过离子辐射诱变菌株，提高石油烃降解能力的方法。此方法适应性强，稳定性好，但是菌株的石油烃降解能力提升不显著。本专利技术能明显提高菌株正突变率，96孔板高通量筛选大幅提高菌株筛选效率。
技术实现思路
为了解决上述现有技术问题，本专利技术的目的在于提供一种操作方便、高突变率、筛选效率高的复合诱变菌株新方法。采用该方法选育的菌株石油烃降解能力有较大程度提高，进而提高菌株降解效率，降低成本，社会和经济效益明显。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种高通量选育石油降解突变株的方法。其特别之处在于：分别确定使戈登氏菌株致死率为70-80％左右的氯化锂浓度和ARTP诱变时间。将菌悬液通过ARTP诱变系统诱变适宜时间后，涂布于含适宜浓度氯化锂的TSB固体培养基中进行二次诱变。挑选复合诱变菌株转接至含油培养基的深96孔板中，结合紫外分光光度法高通量选育诱变菌株。具体步骤如下：(1)菌悬液的制备：将戈登氏菌株接种于TSB液体培养基中，28-30℃、180-220r震荡培养46-48h，10000×g离心2min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后制成菌悬液。血球计数板计数并调节菌体浓度为0.6×107-0.8×107/mL左右备用。(2)含氯化锂的TSB固体培养基的制备：按质量分数0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％的梯度向TSB固体培养基中加入氯化锂水溶液。(3)由步骤(2)所得的含不同浓度氯化锂TSB固体培养基中滴加20-30μL菌悬液，涂布均匀，30℃恒温培养120h，记录每皿中菌落数，计算致死率。挑选致死率在70％-80％左右的平皿中菌株，于TSB液体培养基中扩大培养，以10％接种量接种到石油含量为1％的无机盐液体培养基，28-30℃、180-220r震荡培养10天，以重量法测定石油烃降解率。(4)取10μL菌悬液注射到ARTP诱变系统专用铁片上，无菌风吹干形成菌膜，以氦气为工作气体，气流量设定为10L/min，作用距离3mm，作用功率120W的等离子体射线辐照处理，操作温度为28-30℃，处理时间分别设定为0、60、120、180、210、240、270、300s。将经过不同辐照时间处理的菌膜以2mL无菌生理盐水洗脱制成菌悬液。以未经诱变的菌株为对照，稀释涂TSB培养基平板，培养120h，计算致死率。挑选致死率在70％-80％左右的平皿中菌株，于TSB液体培养基中扩大培养，以10％接种量接种到石油含量为1％的无机盐液体培养基，28-30℃、180-220r震荡培养10天，以重量法测定石油烃降解率。(5)分别选择菌株致死率为70％-80％左右的氯化锂水溶液浓度和ARTP适宜诱变时间。取步骤(1)中菌悬液，以适宜诱变时间经步骤(4)处理后，涂布于含适宜浓度氯化锂溶液的TSB固体培养基中，28-30℃培养118-120h。(6)依次配置浓度为0、20、40、60、80、100mg/L的石油-石油醚标准液，依测量系列标准溶液的OD225值，根据各浓度标准液所测得的ABS值绘制OD-石油浓度标准曲线。(7)挑取复合诱变菌株接种到每孔含1mLTSB液体培养基的深96孔板中，对照孔接入未经诱变菌株。28-30℃、180-220r震荡培养46-48h后转接至含油培养基的深96孔板中，接种量为10％，28-30℃、180-220r振荡培养118-120h。每孔加入450-550μL石油醚以萃取残油。每孔移取200μL上层液体加入至酶标板中，利用多功能酶标仪检测225nm下的吸光值，根据标准曲线计算石油烃降解率。(8)培养基组成TSB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨16.5-17.5、大豆蛋白胨2.5-3.0、氯化钠4.5-5.0、磷酸氢二钾2.3-2.8、葡萄糖2.2-2.5、pH7.2-7.4、1.01×105pa灭菌20min。TSB固体培养基(g/L)：在TSB液体培养基基础上，添加琼脂19.5-20g，1.01×105pa灭菌20min。含油无机盐培养基(g/L)：氯化钠24.0-24.5、硫酸镁0.2-0.3、硝酸铵1.0-1.2、氯化钾0.7-0.8、磷酸二氢钾1.0-1.2、磷酸氢二钾1.0-1.2、磷酸氢二钠3.0-3.5、1％石油、pH7.6-7.8，1.01×105pa灭菌20min。本专利技术的的积极意义1.常温室压等离子体诱变是近年来新兴的一种高效率诱变技术，具有操作简便、条件温和、不需要真空条件、安全性高、诱变快速、突变率高等特点，可以大大提高菌种突变的强度，等离子体射流温度低且活性粒子分布均匀，对环境及人没有危害。2.化学诱变与常温室压等离子体诱变复合使用，既可克服单独化学诱变时负突变率高、子代生长缓慢的缺点，又可避免单一诱变所产生的诱变饱和效应，能够有效弥补常规诱变育种的不足。3.本专利技术采用的Licl-ARTP复合诱变育种，方法简单，操作方便，变异稳定性好，正突变率高，可以大大提高筛选效率。普通技术人员均可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量选育石油降解突变株的方法，其特征在于：将种子液离心重悬，得到菌悬液并调节至适宜菌体密度。分别采用单一化学诱变、常温室压等离子体诱变(ARTP)以及单一化学诱变和常温室压等离子体诱变系统(ARTP)复合诱变方法对菌悬液进行诱变。将诱变后菌株接种到含油培养基的深96孔板中培养，以紫外分光光度法计算孔板中残油含量，测定石油烃降解率。选取石油烃降解能力高且稳定的诱变菌株。

【技术特征摘要】
1.一种高通量选育石油降解突变株的方法，其特征在于：将种子液离心重悬，得到菌悬液并调节至适宜菌体密度。分别采用单一化学诱变、常温室压等离子体诱变(ARTP)以及单一化学诱变和常温室压等离子体诱变系统(ARTP)复合诱变方法对菌悬液进行诱变。将诱变后菌株接种到含油培养基的深96孔板中培养，以紫外分光光度法计算孔板中残油含量，测定石油烃降解率。选取石油烃降解能力高且稳定的诱变菌株。2.根据权利要求1所述的一种高通量选育石油降解突变株的方法，其特征在于，菌株经扩大培养并离心重悬后，用血球计数板调节菌体浓度为0.6×107-0.8×107/mL。3.根据权利要求1所述的一种高通量选育石油降解突变株的方法，其特征在于，以0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％梯度向TSB固体培养基中加入氯化锂水溶液。4.根据权利要求1所述的一种高...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟成，刘正，田亚东，贾士儒，谢燕燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12