高产γ-氨基丁酸的诱变菌株及其生物制剂制造技术

本发明专利技术提供一种诱变的植物乳杆菌及其生物制剂，其中该诱变菌是(KJY‑HN001‑01‑02)，CGMCCNO.15422，保藏日期为2018年03月07日。本发明专利技术还提供该诱变菌所制备的生物制剂，用于高产γ‑氨基丁酸的用途。本发明专利技术还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌进行复配，以生产富含γ‑氨基丁酸的酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的用途。

【技术实现步骤摘要】
高产γ-氨基丁酸的诱变菌株及其生物制剂
本专利技术属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，并通过该诱变菌来高产γ‐氨基丁酸的用途。
技术介绍
γ‐氨基丁酸(gamma‐aminobutyricacid，GABA)，又称氨酪酸、4‐氨基丁酸，分子式为C4H9O2N，相对分子质量为103.12。结构式及三维结构如下：γ‐氨基丁酸是2017被国家卫计委批准新资源食品，γ‐氨基丁酸是广泛存在于动植物体内的一种天然存在的非蛋白质类氨基酸。在植物中，γ‐氨基丁酸参与胁迫反应和调节植物生长方向；在动物中，γ‐氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性、健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症、活化肝功能。每日补充微量的γ‐氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。获得GABA的方法有化学合成法和植物富集和发酵合成法三大类。化学合成反应剧烈、得率低，存在安全隐患，而生物合成法中的植物富集法存在产量低的缺点。发酵合成法因具有产量高的优点而成为目前主要的生产方法。GABA的生产菌种主要有大肠杆菌,霉菌,酵母及乳酸菌等。而其中大肠杆菌，霉菌用于医药食品行业存在安全方面的隐患，酵母产量极低，所以大部分研究人员都致力于乳酸菌的筛选。然而，具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力因菌株的种属不同而差异较大。许多研究表明，来源多样的短乳杆菌(Lactbacillusbrevis)合成GABA的能力比较突出。泡菜是高产GABA乳酸菌的重要来源之一，从泡菜中筛选得到高产GABA的短乳杆菌也比较多，例如在中国传统发酵食品酸菜中分离到高产GABA的短乳杆菌([J].AminoAcid,2010,38:1439‐1445)。此外，黄俊(利用短乳杆菌制备γ‐氨基丁酸的相关过程研究，浙江大学博士学位论文)报道了从自然界选育得到一株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，经过普通发酵72小时，发酵液中γ‐氨基丁酸含量可分别达到6.9g/L。鉴于植物乳杆菌相比于短乳杆菌的优势，目前也成为利用微生物发酵生产GABA的研究热点。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)属于芽胞杆菌纲(Bacilli)乳杆菌属(Lactobacillus)，常存在于发酵的蔬菜、果汁中等植物蛋白乳酸菌发酵食品中，革兰氏阳性，不生芽孢，兼性厌氧，属化能异养菌。能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85％以上是乳酸。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH值为6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。作为人和动物肠道重要的益生菌群，在代谢过程中，植物乳杆菌能通过竞争性抑制作用在胃肠道内占位、定植，抑制致病菌对胃肠道侵害，具有调节肠道菌群平衡，提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种作用。植物乳杆菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。渠岩等人(“发酵食品中产氨基丁酸植物乳杆菌S35的筛选鉴定”，中国农业大学学报2010，15(5):104‐109)报道了从传统发酵食品中分离筛选高产C‐氨基丁酸(GABA)的乳酸菌。采用薄层层析法和高效液相色谱法对分离出的82株乳酸菌的GABA生产能力进行定性和定量分析，筛选出1株高产GABA的乳酸菌S35，其在没有优化的普通培养基中(即含1％质量分数/质量浓度的谷氨酸的GYP或TYG培养基或MRS培养基)产量达到4.52g/L；刘佳荣(微生物发酵合成γ‐氨基丁酸的研究，哈尔滨商业大学硕士学位论文，2015年)报道了从自然界选育得到一株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，经过在1％谷氨酸钠条件下的TYG培养基中发酵72小时，发酵液中γ‐氨基丁酸含量可分别达到5.833g/L。中国专利申请2014107305157、专利技术名称“一种高产氨基丁酸乳酸菌及其筛选方法”公开了一种通过谷氨酸脱羧酶活性对氨基丁酸产生菌进行筛选的方法。在未使用诱变技术的情况下，得到一株植物乳杆菌，该乳杆菌经过在1％质量分数谷氨酸钠条件下发酵培养后，GYP培养基发酵液中γ‐氨基丁酸含量达到5.025g/L。总体而言，对于所获得的植物乳杆菌进行发酵生产的GABA的现有研究中，仅仅以GABA产量为指标而不加入其它诱导因素，通过普通发酵培养(如1％谷氨酸钠条件下的GYP或TYG培养基或MRS培养基培养)而获得的γ‐氨基丁酸表达水平一般难以超过7.0g/L。李理(产γ‐氨基丁酸乳酸菌及其应用，《中国乳品工业》，第42卷第2期，2014)报道了影响乳杆菌合成GABA的多种因素，认为不同发酵条件会影响GABA的产量和产率，主要因素有底物L‐谷氨酸及其盐类L‐谷氨酸钠的添加量、辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量、pH值、发酵时间和发酵基质等。其中底物浓度会直接影响GABA产生的数量和速率；另外PLP是转氨酶和脱羧酶类的辅酶，它能够促进谷氨酸的脱羧，促进GABA的产生，因此辅酶的添加量也是影响GABA产量的重要因素之一。例如，在MRS培养基中添加一定量的Glu和PLP使得副干酪乳杆菌合成GABA的能力明显提高，当底物添加量为500mmol/L(相当于7.35％质量分数)时GABA产量最高可达到161mmol/L。植物乳杆菌DSM1946在添加了18.4mmol/LL‐谷氨酸钠(相当于0.31％质量分数)的葡萄汁和乳清中GABA的产量为4.83mmol/L，较不添加底物和辅酶时有所提高。因此，现有研究中，集中于在将发酵培养基中的底物(谷氨酸或谷氨酸钠)的质量分数提高至合适的比例，能够获得GABA高产率和成本最优的效果。例如，黄桂东(《食品科学》第34卷第17期，2013年)通过单因素试验考察了葡萄糖、谷氨酸钠、氮源等对植物乳杆菌产氨基丁酸的影响，其中比较了0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％质量浓度的L‐谷氨酸钠对于GABA产量的影响，结果表明随着谷氨酸钠质量浓度的增大，GABA的产量也随之增加，例如4％质量浓度的L‐谷氨酸钠，相比于1％质量浓度的L‐谷氨酸钠，GABA的产量提高3倍以上。然而，当谷氨酸钠质量浓度超过20g/L后，菌体浓度基本保持不变，虽然GABA产量依然增加，但是L‐谷氨酸钠的转化率上是不断降低的。这意味着在实际生产过程中，过高的底物浓度是不利于生产成本的节约和转换率的提高。除了优化碳源、底物、氮源和培养基成分之外，为了进一步提高GABA的产量，黄俊(利用短乳杆菌制备γ‐氨基丁酸的相关过程研究，浙江大学博士学位论文)进一步分析对高产菌株的诱变因素，其中在已有6.9g/L高产GABA短乳杆菌的基础上，通过UV和γ射线反复诱变处理，获得一种高产突变株，发酵72小时的产量达到17g/L，这预示着诱变因素相比于碳源、底物、氮源和培养基成分，更能提高GABA产量。在此基础上，黄俊进一步分析影响突变株表达产量的效应评价，筛选出具有显著正效应的3个因素，即葡萄糖、四水硫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产氨基丁酸的植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产氨基丁酸的植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.用于诱变权利要求1所述的菌株的制备方法，步骤包括，(1)将冻存的植物乳杆菌分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间为60s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育45min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)‐(6)，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐亚硝基胍连续诱变2代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；(8)检测氨基丁酸产量：选择生长形状最良好的多个单菌落分别单一接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养24h，以2％(体积分数)接种量转接与GYP种子培养基中，37℃下继续培养24h；然后将培养液按2％(体积分数)接种量接种于100mLGYP发酵培养中，37℃下培养24‐48h，取发酵液5mL于沸水浴中煮沸5min，冷却后离心并保留上清；清液经薄层层析和高效液相色谱分析后，确定高产GABA的菌株；(9)选择生长形状最良好的多个个菌落，按照步骤(6)进行复筛，最终获得1株优良突变株，通过步骤8的方法检测，其在含2‐5％的谷氨酸的GYP普通发酵培养基中，GABA的含量约12.75‐31.88g/L，底物摩尔转换率约91‐93％；在5％‐8％底物浓度及其其他优化条件下下，GABA的产率为33.95‐53.70g/L；(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌KJY12，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15422。3.通过如权利要求1所述的菌株，或如权利要求2的方法所制备的菌株生产富含GABA的食用溶液的方法，包括：(1)将保藏的植物乳杆菌KJY12于MRS液体培养基中活化培养；(2)在豆浆、豆清液或米浆、豆酸奶或食用酸汤中加入0.1‐0.2％重量的碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，调整pH6.0‐8.0，50℃水浴中孵育1‐3h，进行酶解；(3)将活化的培养液，以108CFU/ml的浓度加入预先酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胤，李肯，赵聃，
申请(专利权)人：湖南肯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43