一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法，所述重组菌为蝗绿僵菌CQMa102敲除腺苷酸形成还原酶Adenylate‑Forming Reductases（AFR）基因后的工程菌株，MaAFR为新发现的毒力基因，经蝗虫生测试验结果表明其半致死率较野生型菌株提高了1天，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染致病的分子机理以及增强菌株可用性十分重要。

【技术实现步骤摘要】
一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及利用基因工程方法改良获得一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株。
技术介绍
昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，具有专一性、安全性、不会使昆虫产生抗性等优点，可形成广泛且持续的控害作用，因此是最具潜力的生物农药。绿僵菌(Metarhiziumacridum)是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌，利用它来防治害虫的研究与实践已愈百年。迄今，国内外已登记的绿僵菌杀虫剂产品有100多种，在非洲、澳大利亚、巴西以及中国等国家已用在农林害虫防治方面(ASchranketal.,2010，JoVEBioengineering.,56:1267-1274)。自上世纪90年代，利用绿僵菌防治蝗虫取得重大突破，被世界卫生组织推荐为防治蝗虫的重要生物农药，目前在国际上广泛应用，我国2003年也成功开发出防治东亚飞蝗的杀蝗绿僵菌。但是，在其实际应用中，杀虫真菌农药存在杀虫慢，防效低的问题，这严重地制约了其广泛应用。所以选育高毒力的杀虫真菌菌株成为杀虫真菌研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingReductases(AFR)基因的工程菌株。上述蝗绿僵菌采用蝗绿僵菌CQMa102菌株，上述AFR基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQIDNO.9所示。上述蝗绿僵菌CQMa102菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其登录号为CGMCCNo.0877，已申请授权，专利授权公告号CN1216144C。进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的AFR基因被由AFR基因的上游同源臂，标记基因以及AFR基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优先采用草铵膦标记Bar基因。上述蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。本专利技术另一目的在于提供一种杀虫效果好的杀虫菌剂。一种杀虫菌剂，它的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingRductases(AFR)基因的重组菌。优选地说，上述杀虫菌剂中蝗绿僵菌采用蝗绿僵菌CQMa102菌株，所敲除的AFR基因为蝗绿僵CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQIDNO.9所示。进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的AFR基因被由AFR基因的上游同源臂，标记基因以及AFR基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优选采用草铵膦标记Bar基因。本专利技术的又一目的在于提供上述高毒力蝗绿僵菌工程菌株的构建方法。上述构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：1)PK2-PB-MaAFR-L/R重组质粒的构建根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出腺苷酸形成还原酶蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为SEQIDNO.10所示，下游同源重组臂为SEQIDNO.11所示，酶切载体质粒PK2-PB并纯化线性质粒，上游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到PK2-PB-MaAFR-L/R重组质粒；2)回复载体(PK2-MaAFR-sur::egfp)的构建从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaAFR自身启动子与编码区的序列，MaAFR的cDNA的序列为SEQIDNO.9所示，与PK2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接；3)农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养将PK2-PB-MaAFR-L/R的质粒转化农杆菌后与蝗绿僵菌的共培养发生同源重组，回复转化使用ΔMaAFR蝗绿僵菌孢子；4)蝗绿僵菌转化子的筛选经PCR初步验证转化子及Southernblot验证得到蝗绿僵菌MaAFR基因敲除突变株以及回复菌株。本专利技术获得的有益效果：本专利技术提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方，所述工程菌为蝗绿僵菌CQMa102敲除腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingReductases(AFR)基因后的工程菌株，MaAFR为新发现的毒力基因，将敲除菌点滴接种的蝗虫在7天死亡率达到100％，而野生型以及回复菌株点滴的蝗虫死亡率约60％，直到第10天才达到100％，敲除菌株相较于野生型以及回复菌株对蝗虫的半致死时间提前1天左右，经蝗虫生测试验结果表明其半致死率较野生型菌株提高了1天，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染致病的分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供了一种新型的杀虫菌剂。附图说明图1：A为腺MaAFR除载体构建示意图，B为回复载体构建示意图。图2：MaAFR基因敲除菌株和回复菌株的Southernblot验证结果。图3：蝗虫生物测定试验十天内蝗虫致死率。图4：为蝗虫生物测定试验蝗虫半致死时间。具体实施方式实施例1PK2-PB-MaAFR-L/R重组质粒的构建(1)上下游基因同源臂的扩增根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，所述蝗绿僵菌是由重庆大学杀虫真菌生物农药工程技术研究中心提供，此菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其登录号为CGMCCNo.0877，专利授权号CN1216144C，引物碱基序列LF为SEQIDNO.1所示，LR为SEQIDNO.2所示，RF为SEQIDNO.3所示，RR为SEQIDNO.4所示。MaAFR的cDNA的序列为SEQIDNO.9所示。以蝗绿僵菌基因组为模板，引物分别用LF、LR一组和RF、RR一组，扩增出腺苷酸形成还原酶蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为SEQIDNO.10所示，下游同源重组臂为SEQIDNO.11所示。按照下列体系加样：rTaqDNAPolymerase0.3μl10×LABuffer(Mg2+Plus)5μldNTPs0.5μlForwardprimer(10μM)1μlReverseprimer(10μM)1μlcDNA模板1μlddH2O11.5μl终体积20μl加样完成后离心混匀样品，于PCR仪中按照下列程序进行反应：(2)酶切载体质粒提取带有载体质粒PK2-PB的大肠杆菌质粒，PK2-PB载体是pAN52-1载体(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建而来由本实验室保存，以构巢曲霉基因组DNA为模板对pTrpC启动子及其所控制的草铵膦标记Bar基因序列进行融合PCR扩增，扩增引物见SEQIDNO.14，SEQIDNO.15，SEQIDNO.16，SEQIDNO.17，将pAN52-1与扩增片段分别用BamHI和EcoRV(TaKaRa，日本)进行双酶切，使用T4连接酶(TaKaRa，日本)进行连接得到PK2-PB载体。使用HindIII和XbaI酶切载体质粒PK2-PB并纯化线性质粒。(3)质粒与同源臂的连接将4μL上游重组臂片段与1μL线性质粒在重组酶中进行一步克隆：体系如下：NovoRec10x重组缓冲液1μgNovoRec重组酶0.5μl线性化载体(＞15ng/μL)Nμl插入片段NμlddH2Oupto10μl终体积10μl线性化载体以及插入片段比例可登录www.sinobio.net在线计算，混匀后在37℃放置20-40分钟，得到重组产物。(4)转化大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate‑Forming Reductases（AFR）基因的工程菌株。

【技术特征摘要】
1.一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingReductases（AFR）基因的工程菌株。2.如权利要求1所述的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌采用CQMa102菌株；所述所敲除的AFR基因为蝗绿僵CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQIDNO.9所示。3.如权利要求1或2所述的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：在所述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的AFR基因被由AFR基因的上游同源臂，标记基因以及AFR基因的下游同源臂组成的重组基因代替。4.如权利要求1-3任一项所述的蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。5.一种杀虫菌剂，其特征在于：所述杀虫菌剂的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingReductases（AFR）基因的工程菌株。6.如权利要求5所述的杀虫菌剂，其特征在于：所述蝗绿僵菌采用CQMa102菌株；所敲除的AFR基因为蝗绿僵CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQIDNO.9所示。7.如权利要求5或6所述的杀虫菌剂，其特征在于：在...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭国雄，夏玉先，郭浩宇，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50