一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物菌株技术领域，具体涉及一种烟曲霉LSD‑1及其培养方法和应用。烟曲霉LSD‑1为Aspergillus fumigatus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15985，保藏日期为2018年06月25日。培养方法：无菌水洗涤烟叶表面2～3次，收集沉淀；将沉淀用15mL生理盐水稀释后，按10％接种量接种到分离培养基中，在32℃，150r/min的摇床中培养3d得到培养液；将培养液涂于固体分离培养基平板上，在32℃的培养箱中培养3d得到烟曲霉LSD‑1菌落。这种烟曲霉LSD‑1能够将甾醇降解为二氧化碳和水，对甾醇降解率达到57.83％。

【技术实现步骤摘要】
一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用
本专利技术属于微生物菌株
，具体涉及一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用。
技术介绍
烟草中植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能够促进烟草的生长，而且对烟草的安全、品质都有较大的影响。烟草中甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇以及胆甾醇4种化合物，霉变的烟叶中可能还有麦角甾醇。这些甾醇类物质在烟叶成熟后对烟草品质没有多少贡献，反而是烟气中致癌物稠环芳烃(PAHs)的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[a]芘由它裂解产生。稠环芳烃不仅降低烟草的安全性，影响烟草的感官品质，而且对消费者的健康起到负面的影响。
技术实现思路
本专利技术提供的一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用。本专利技术的烟曲霉能够有效的降解烟草中的甾醇。本专利技术提供了一种烟曲霉LSD-1，所述烟曲霉LSD-1为Aspergillusfumigatus，所述烟曲霉LSD-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15985，保藏日期为2018年06月25日。本专利技术提供了一种烟曲霉LSD-1的培养方法，首先，用无菌水洗涤烟叶表面2～3次，收集沉淀；然后，将沉淀用15mL生理盐水稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，并在32℃，150r/min的摇床中培养3d，得到培养液；最后，将上述培养液涂于固体分离培养基平板上，并于32℃的培养箱中培养3d，得到烟曲霉LSD-1菌落。进一步的，所述烟叶为雪茄烟烟叶。进一步的，所述分离培养基由以下成分制得：将1.8gNa2HPO4·12H2O、1gK2HPO4·3H2O、2g(NH4)2HPO4、2gNaNO3、1mgCaCl2·2H2O、1mgFeSO4·7H2O、0.1gMgSO4、1.8gZnSO4·7H2O、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液，然后混合液进行超声震荡，并121℃下灭菌30min，得到分离培养基；所述固体分离培养基平板由以下成分制得：将1.8gNa2HPO4·12H2O、1gK2HPO4·3H2O、2g(NH4)2HPO4、2gNaNO3、1mgCaCl2·2H2O、1mgFeSO4·7H2O、0.1gMgSO4、1.8gZnSO4·7H2O、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液；然后混合液进行超声震荡后，再向混合液中加入琼脂，并121℃下灭菌30min，得到固体分离培养基平板；其中，每100mL的混合液中加入2g琼脂。本专利技术提供一种烟曲霉LSD-1在降解甾醇中的应用。进一步的，所述甾醇为豆甾醇。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的烟曲霉LSD-1能够将豆甾醇为二氧化碳和水，且豆甾醇的降解率达到57.83％。生物材料保藏信息说明LSD-1，在本申请中称作烟曲霉LSD-1，已于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15985，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，分类命名为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)附图说明图1是显微镜下实施例1烟曲霉LSD-1菌体形态特征；图2是实施例1的烟曲霉LSD-1降解豆甾醇过程中中间产物含量图；图3是实施例2中豆甾醇的标准曲线；图4是实施例2中待测样品1的超高效液相色谱-质谱测试谱图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。本专利技术以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。实施例1：曲霉LSD-1的分离与鉴定1、培养基配方(1)分离培养基的制备过程如下：将1.8gNa2HPO4·12H2O、1gK2HPO4·3H2O、2g(NH4)2HPO4、2gNaNO3、1mgCaCl2·2H2O、1mgFeSO4·7H2O、0.1gMgSO4、1.8gZnSO4·7H2O、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液，然后混合液进行超声震荡，以使豆甾醇在培养基中分散均匀，121℃灭菌30min，得到分离培养基；(2)固体分离培养基平板的制备过程如下：将1.8gNa2HPO4·12H2O、1gK2HPO4·3H2O、2g(NH4)2HPO4、2gNaNO3、1mgCaCl2·2H2O、1mgFeSO4·7H2O、0.1gMgSO4、1.8gZnSO4·7H2O、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液；然后混合液进行超声震荡后，再向混合液中加入琼脂，121℃灭菌30min，将液体倒入培养皿，得到固体分离培养基平板。其中，每100mL的混合液中加入2g琼脂。2、烟曲霉LSD-1的分离和培养首先，用无菌水洗涤雪茄烟烟叶(采集自海南省五指山市)表面2～3次，收集沉淀；然后，将沉淀用15mL生理盐水稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，并在32℃，150r/min的摇床中培养3d，得到培养液；最后，将上述培养液涂于固体分离培养基平板上，并于32℃的培养箱中培养3d，得到烟曲霉LSD-1菌落。3、烟曲霉LSD-1的鉴定(1)显微观察用无菌的接种针从固体分离培养基平板上挑取一环菌体，置于载玻片上的水体中，用显微镜观察，如图1所示，菌落为绿色球形菌落。(2)分子鉴定提取DNA，通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCT-GCCG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增整个ITS序列，并进行PCR产物的纯化和扩增，然后由天津金唯智公司完成测序，测序结果经DNAMAN软件去除载体后，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank数据库，利用BLAST工具进行序列比对，对样品进行鉴定。4、结果与分析本专利技术筛选到的霉菌为烟曲霉LSD-1，序列长度为574bp，序列如序列表所示。其与烟曲霉(Asperqillusfumigatus)的同源性达99％，其培养特征及显微形态特征与烟曲霉(Asperqillusfumigatus)最相似。该菌株已于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.15985；地址为：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所。实施例2：烟曲霉LSD-1对甾醇的降解能力1、一级种子的制取取一支烟曲霉LSD-1菌株斜面，用无菌接种环轻轻刮下表面的孢子，置于含有100mL无菌无机盐培养液中，150r/min，32℃培养3-5天，待孢子球长至2mm左右，进入快速生长期，备用，此为一级种子。2、实验过程用灭菌过的纱布过滤上述孢子液体，并用灭菌过的生理盐水洗涤两次孢子，取湿重为5g的孢子接种到甾醇含量为0.1％的100mL的液体培养基中，瓶口用无菌透气封口膜封口，放置恒温振荡培养箱中150r/min，32℃培养，每培养7d进行取样，在每个样品中加入等体积二氯甲烷萃取三次，旋涡振荡10min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液，合并二氯甲烷萃取液，并用旋转蒸发仪蒸干，干燥后的样品溶入色谱级甲醇以备后期液相色谱-质谱分析使用。3、结果分析(1)中间产物的分析判断采用薄层层析(TLC)法：采用分析用硅胶板，展层剂为石油醚:乙酸乙酯＝3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟曲霉LSD‑1，其特征在于，所述烟曲霉LSD‑1为Aspergillus fumigatus，所述烟曲霉LSD‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15985，保藏日期为2018年06月25日。

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉LSD-1，其特征在于，所述烟曲霉LSD-1为Aspergillusfumigatus，所述烟曲霉LSD-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15985，保藏日期为2018年06月25日。2.如权利要求1所述的烟曲霉LSD-1的培养方法，其特征在于，具体操作如下：首先，用无菌水洗涤烟叶表面2～3次，收集沉淀；然后，将沉淀用15mL生理盐水稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，并在32℃，150r/min的摇床中培养3d，得到培养液；最后，将所述培养液涂于固体分离培养基平板上，并于32℃的培养箱中培养3d，即得到烟曲霉LSD-1菌落。3.如权利要求2所述的烟曲霉LSD-1的培养方法，其特征在于，所述烟叶为雪茄烟烟叶。4.如权利要求2所述的烟曲霉LSD-1的培养方法，其特征在于，所述分离培养基的制备过程如下：将1.8gNa2HPO4·12H2O、1gK2HPO4·3H2O、2g(...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓平，赵铭钦，刘芳，郭乐乐，席高磊，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41