一种多糖及用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种多糖及用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途。本发明专利技术提供的纯化多糖A、B、D、E、F均一性较好，经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖A、B、D、E、F对体外培养的猪卵母细胞具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪卵母细胞成熟。

【技术实现步骤摘要】
一种多糖及用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途
本专利技术属于畜牧领域，涉及一种多糖及用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途。
技术介绍
水菖蒲Acoruscalamus为天南星科Araceae多年水生草本植物，别名菖蒲，臭菖蒲，白菖蒲等。以根茎入药，具有开窍，化痰，健胃，益智，散风，活血等功效。生于海拔2600m以下的水边、沼泽湿地或湖泊浮岛上，在南北两半球的温带、亚热带，与我国各省均有分布。卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定卵母细胞的质量，影响胚胎的发育。通过在培养液中添加激素、细胞因子或生长因子等促进卵母细胞成熟已取得一定进展，但是体外成熟的卵母细胞的发育能力仍然不及体内成熟的卵母细胞，这说明卵母细胞的体外成熟体系还不完善，仍需要进一步优化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多糖及用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途。本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：一种多糖，通过如下方法制备得到：S1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲Acoruscalamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；S2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-SepharoseFastFlow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；S3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.2mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖。优选地，步骤S1固液比为1:5。优选地，步骤S1提取3次，每次2h。优选地，步骤S1以Sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层。优选地，步骤S1加入4倍体积无水乙醇沉淀多糖。优选地，步骤S1加无水乙醇后于4℃静置24h。优选地，步骤S1加无水乙醇静置后以3000r/min离心10min收集沉淀。上述多糖用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途。有益效果：本专利技术提供的纯化多糖A、B、D、E、F均一性较好，经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖A、B、D、E、F对体外培养的猪卵母细胞具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪卵母细胞成熟。附图说明图1为纯化多糖A的HPGPC图；图2为纯化多糖B的HPGPC图；图3为纯化多糖C的HPGPC图；图4为纯化多糖D的HPGPC图；图5为纯化多糖E的HPGPC图；图6为纯化多糖F的HPGPC图；图7为各组卵母细胞核成熟率(％)。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容。实施例1：多糖的制备一、实验材料干燥的水菖蒲Acoruscalamus根茎购自亳州中药材市场。二、实验方法和结果1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲Acoruscalamus根茎粉碎，热水沸腾提取，固液比为1:5，提取3次，每次2h；合并提取液，过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入4倍体积的无水乙醇沉淀多糖，4℃条件下静置24h，3000r/min离心10min离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖。2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-SepharoseFastFlow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，分别收集0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/L的NaCl溶液洗脱液，分别冷冻干燥得到不同的初步纯化多糖。3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.1mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第4～5个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖A；称取0.2mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖B；称取0.3mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖C；称取0.5mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第7～8个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖D；称取0.7mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖E；称取0.9mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖F。纯化多糖A～F经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄，表明纯化多糖A～F的均一性较好。纯化多糖A～F的HPGPC图如图1～6所示。实施例2：多糖的药效一、实验材料和实验方法从当地屠宰场搜集初情期前小母猪卵巢，然后用注射器抽取法采集卵巢表面直径2～6mm卵泡的卵母细胞，挑选那些带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)，并随机分配于各试验组中。成熟液为TCM-199与猪卵泡液按照体积比9:1混合而成(还含有1％双抗)，多糖实验组分别加入30mg/mL纯化多糖A～F，对照组不添加，做成100μL微滴，上盖矿物油，培养20～30枚卵母细胞。培养箱条件为：5％CO2的空气、最大相对饱和湿度、38.5℃。COCs经44h成熟培养后，去除卵丘细胞，在50倍实体显微镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多糖，其特征在于，通过如下方法制备得到：S1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲Acorus calamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；S2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE‑Sepharose Fast Flow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；S3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.2mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS‑200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖。

【技术特征摘要】
1.一种多糖，其特征在于，通过如下方法制备得到：S1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲Acoruscalamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；S2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-SepharoseFastFlow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；S3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.2mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶培德，
申请(专利权)人：叶培德，
类型：发明
国别省市：江苏,32