一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，同时本发明专利技术涉及一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的制备方法，第三方面，本发明专利技术公开了B细胞优势表位串联基因和融合蛋白在制备疫苗中的应用，本发明专利技术通过软件筛选出猪链球菌保护性抗原GAPDH、MRP和DLDH的B细胞优势表位并以氨基酸序列为GGGG的柔性片段进行串联，将上述串联片段构建重组表达载体进行原核表达，纯化表达的融合蛋白并与弗氏佐剂制成疫苗制剂，经小鼠免疫效力评价表明该疫苗能够对2型猪链球菌提供高效的免疫保护效力，相对于传统灭活疫苗和弱毒疫苗，本发明专利技术提供的基因工程疫苗具备制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法
本专利技术涉及基因工程亚单位疫苗生产领域，尤其涉及一种猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis)是一类重要的人兽共患病原菌，可引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血症等疾病。目前已知35个血清型(1-34，1/2)，其中1、2、7、9型为致病型，又以2型的致病性为最强，在我国流行最广，猪群携带率较高(XUJ,MUY,ZHANGY,etal.AntibacterialeffectofporcinePTX3againstStreptococcussuistype2infection.[J]MicrobPathog,2015,89:128-139)。1998年江苏和2005年四川先后暴发猪链球菌疫情，对我国养猪业造成较大冲击(YUH,JINGH,ChenZ,etal.HumanStreptococcussuisoutbreak,Sichuan,China.[J]EmergInfectDis,2006,12(6):914-920)。当前，猪群中猪链球菌的防治主要依靠疫苗接种，但是传统疫苗存在交叉保护力不佳以及生物安全隐患等多种问题，而基因工程亚单位疫苗具有纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。抗原表位是免疫识别的标志，是抗原特异性的结构基础，同时也是全抗原引起的保护性免疫应答的主要途径。因此，基于B细胞优势表位的疫苗设计，可以激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力。现有技术表明磷酸-3-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-releasedprotein，MRP)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamidedehydrogenase，DLDH)是猪链球菌中的三个重要保护性抗原，然而目前尚未有针对以上三种抗原分子尤其是三种抗原分子相结合进行B细胞优势抗原表位分析设计，并由此生产基因工程疫苗的的相关报道。因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于优势B细胞抗原表位筛选的新型高效猪链球菌基因工程疫苗及其制备方法，具有制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点，相对于存在灭活工艺安全性隐患的传统灭活疫苗，以及存在毒力返强以及潜在的生物安全性问题的弱毒疫苗具有明显优势。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种基于优势B细胞抗原表位筛选的新型高效猪链球菌基因工程疫苗及其制备方法，该疫苗能够激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力。为实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，该串联蛋白为融合蛋白。进一步地，进一步地，融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。第二方面，本专利技术提供了一种制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，步骤包括：(1)B细胞优势表位筛选；(2)B细胞优势表位串联基因设计及质粒的构建；(3)融合蛋白表达及纯化；(4)制备所述B细胞优势表位串联疫苗；(5)所述疫苗的免疫效力评价。进一步地，猪链球菌为猪链球菌ZY05719菌株；进一步地，步骤(1)具体操作步骤为：分析猪链球菌GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白一级结构信息，设计B细胞优势表位串联疫苗时删除信号肽段、膜锚定结构域和处于膜内的肽段，利用ABCpred工具、BepiPred工具预测GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的B细胞优势表位片段，分析GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的二级结构，确定GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白的B细胞优势表位。进一步地，最终确定GAPDH蛋白的优势B细胞表位区段为：79-85，188-200，268-278；MRP蛋白优势B细胞表位区段为:245-260，296-311，443-472，611-619，659-669，809-837，880-905，923-938，1034-1049，1202-1217；DLDH蛋白优势B细胞表位区段为：21-32，451-457。进一步地，步骤(2)具体操作步骤为：将步骤(1)所得的B细胞优势表位的不同片段按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序通过柔性肽段串联在一起，在N端和C端分别引入酶切位点，完成B细胞优势表位串联基因设计，形成融合蛋白基因，进而构建质粒。进一步地，N端引入的酶切位点为BamHI位点。进一步地，C端引入的酶切位点为XhoI位点。进一步地，融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步地，柔性肽段的氨基酸序列为GGGG。进一步地，步骤(3)具体操作步骤为：将步骤(2)所得的质粒利用热激转化法转入大肠杆菌中，经测定评价后，确认串联蛋白表达菌株，经诱导培养后，采用His镍柱纯化表达的融合蛋白。进一步地，步骤(4)具体操作步骤为：利用弗氏佐剂和步骤(3)获得的融合蛋白制备所述B细胞优势表位串联疫苗。进一步地，融合蛋白与弗氏佐剂的体积比为1:1。第三个方面本专利技术提供了B细胞优势表位串联基因和融合蛋白的应用。上述应用为，B细胞优势表位串联基因和融合蛋白在制备疫苗中的应用，用于提供抗2型猪链球菌的免疫应答。本专利技术将通过生物信息学软件筛选出的猪链球菌保护性抗原GAPDH、MRP和DLDH优势B细胞表位通过氨基酸序列为GGGG的柔性片段进行串联(简称GMD蛋白)，构建重组质粒GMD-pET28a，将原核表达并纯化后的GMD蛋白配合弗氏佐剂制成的疫苗制剂免疫雌性BALB/c小鼠，该蛋白对2型猪链球菌HA9801菌株能够提供高效的免疫保护效力，相对于存在灭活工艺安全性隐患的传统灭活疫苗，以及存在毒力返强以及潜在的生物安全性问题的弱毒疫苗，本专利技术提供的基因工程疫苗具备制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术实施例1由TMHMM工具预测的GAPDH蛋白跨膜区结果示意图；图2是本专利技术实施例1由TMHMM工具预测的MRP蛋白跨膜区结果示意图；图3是本专利技术实施例1由TMHMM工具预测的DLDH蛋白跨膜区结果示意图；图4是本专利技术实施例1由SignalP工具预测的GAPDH蛋白信号肽结果示意图；图5是本专利技术实施例1由SignalP工具预测的MRP蛋白信号肽结果示意图；图6是本专利技术实施例1由SignalP工具预测的DLDH蛋白信号肽结果示意图；图7是本专利技术实施例1由SOPMA工具预测的GAPDH-MRP-DLDH蛋白二级结构结果示意图；图8是本专利技术实施例1由Protean软件预测的GAPDH蛋白亲水性及抗原性结果示意图；图9是本专利技术实施例1由Protean软件预测的MRP蛋白亲水性及抗原性结果示意图；图10是本专利技术实施例1由Protean软件预测的DLDH蛋白亲水性及抗原性结果示意图；图11是本专利技术实施例3表位蛋白GMD原核表达PCR鉴定结果示意图；图12是本专利技术实施例3表位蛋白GMD原核表达裂解后SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白为融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌B细胞优势表位串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白为融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)B细胞优势表位筛选；(2)B细胞优势表位串联基因设计及质粒的构建；(3)所述融合蛋白表达及纯化；(4)制备所述B细胞优势表位串联疫苗；(5)所述疫苗的免疫效力评价，其中，所述猪链球菌为猪链球菌ZY05719菌株；步骤(1)具体操作步骤为：分析所述猪链球菌GAPDH蛋白、MRP蛋白和DLDH蛋白一级结构信息，设计所述B细胞优势表位串联疫苗时删除信号肽段、膜锚定结构域和处于膜内的肽段，利用ABCpred工具、BepiPred工具预测所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的B细胞优势表位片段，分析所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的二级结构，确定所述GAPDH蛋白、所述MRP蛋白和所述DLDH蛋白的B细胞优势表位。3.如权利要求2所述的制备猪链球菌B细胞优势表位串联疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)具体操作步骤为：将步骤(1)所得的所述B细胞优势表位的不同片段按照GAPDH-MRP-DLDH的顺序通过柔性肽段串联在一起，在N端和C端分别引入酶切位点，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，孔里程，严亚贤，王兆飞，杨登辉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31