一种利用GEM纯化包涵体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用GEM纯化包涵体的方法，构建重组蛋白与AcmA融合蛋白表达载体，诱导表达得到重组蛋白大部分以包涵体形式存在，利用8M尿素溶解包涵体，利用GEM将溶解的重组蛋白从尿素中吸附分离，然后进行复性。该方法可以利用简单易得的GEM从尿素溶解的包涵体中分离纯化带有AcmA的重组蛋白，并且具有良好的蛋白回收效率，同时可以简化包涵体复性过程，简化操作，降低酶活损失。

【技术实现步骤摘要】
一种利用GEM纯化包涵体的方法
本专利技术涉及一种利用GEM纯化包涵体的方法。
技术介绍
大肠杆菌是最常用的一种重组表达宿主，其具有生长速度快、遗传背景清晰、存在大量操作工具等优点。将pET质粒转入大肠杆菌，利用IPTG诱导进行异源蛋白重组表达是异源表达方面的主流方法。但是大肠杆菌作为表达宿主也存在一些不可避免的缺点，如包涵体形成、缺乏表达后修饰能力等，其中包涵体的形成是最常见、最不可避免的一种现象。包涵体的形成主要是由于大肠杆菌大量表达异源蛋白，部分蛋白无法正确折叠，通过降低诱导温度、降低IPTG的浓度均可以降低包涵体的形成，但是仍不能避免包涵体的形成。包涵体具有正确的一级结构，但是高级结构不正确，导致其不可溶并且没有生物活性。利用变性剂如8M尿素可以将包涵体充分溶解变性，然后再进行复性，可以使不具有酶活的包涵体重新具有全部或部分生物活性。传统的包涵体变性复性过程需要较长的时间，同时需要多步操作。乳酸乳球菌是一种安全级别(GRAS)的菌。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以特异的结合到乳酸乳球菌的细胞壁上，利用这个特性，通过酸煮沸手段去除乳酸乳球菌中大部分蛋白和DNA，得到了无生命的革兰氏阳性基质(Gram-positiveenhancermatrixparticles，GEM)。将蛋白与AcmA的重组融合，其可以特异的结合到GEM上。GEM锚定AcmA融合蛋白具有以下特点：具有良好的生物安全性、具有良好的机械性能和具有良好的蛋白特异结合能力。GEM具有将带有AcmA标签重组蛋白从尿素中结合分离的能力。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种利用GEM纯化包涵体的方法，克服现有技术中包涵体变性复性过程需要较长的时间，同时需要多步操作的问题。本专利技术的技术方案是：一种利用GEM纯化包涵体的方法，按以下步骤进行：1)构建重组蛋白-AcmA融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)8M尿素溶解包涵体；6)GEM从尿素溶解的包涵体中纯化分离重组蛋白；7)包涵体的复性；8)酶活测定。在步骤1)中，以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA(GenBank:ADJ59253.1)锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，扩增得到α-淀粉酶(GenBank:AJE77362.1)的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。在步骤2)中，划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.6-0.9时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.5mM-2mM，诱导温度选择为37℃，诱导时间为18小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。在步骤3)中，利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用PBS充分洗涤，得到GEM。在步骤4)中，4000rpm离心收集诱导后的菌体，利用预冷的PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的PBS中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取沉淀。在步骤5)中，将得到的包涵体沉淀利用8M尿素充分溶解，12000rmp离心，取上清即为尿素溶解包涵体溶液。在步骤6)中，将步骤5得到的尿素溶解包涵体溶液与GEM混匀，室温下搅拌结合20-50分钟，12000rpm离心分离，取沉淀，利用PBS充分清洗以去除非特异性结合和尿素。在步骤7)中，将结合有重组蛋白的GEM重悬与PBS中，4℃过夜复性。在步骤8)中，利用DNS法测定重组蛋白的酶活。本专利技术的有益效果：本专利技术进行重组蛋白与AcmA融合表达，诱导表达以包涵体形式存在，利用制备的GEM作为一种材料，从包涵体的尿素溶解液中将带有AcmA标签的重组蛋白纯化分离，并进行复性，测定其酶活。GEM能够作为一种新的纯化材料，从大部分带有AcmA标签的重组蛋白从包涵体的尿素溶液中纯化分离，利用复性液复性后可以得到具有生物活性的重组蛋白。附图说明图1GEM纯化分离尿素溶解包涵体；其中M：蛋白Marker；1：尿素溶解包涵体；2、3、4、5：GEM第一次、二次、三次、四次吸附分离重组蛋白；6：吸附后残余蛋白；图2复性后的酶活。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进一步详细的说明。实施例1：重组蛋白-AcmA融合表达载体的构建与诱导表达1)引物设计根据乳酸乳球菌NZ9000的AcmA的序列，设计引物AF和AR，引物分别添加HindIII和XhoI酶切位点，；根据解淀粉芽孢杆菌BH072的α-淀粉酶的基因序列，设计引物αF和αR，引物分别添加NcoI和HindIII酶切位点。2)载体构建以乳酸乳球菌NZ9000的基因组为模板，利用PCR扩增得到AcmA的基因片段，双酶切后与质粒pET28a连接，测序正确后得到质粒pET28a-AcmA；以解淀粉芽孢杆菌BH072的基因组为模板，利用PCR扩增得到α-淀粉酶的基因片段，双酶切后与质粒pET28a-AcmA连接，测序正确后得到质粒pET28a-α-amylase–AcmA。构建得到的重组质粒转入大肠杆菌BL21中。3)诱导表达用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基过夜培养，制备种子液，按照1-5％的接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，震荡培养3-5小时，当菌液OD600在0.6-0.9之间时，加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.5mM-2mM，诱导温度选择为37℃，诱导时间为18小时-24小时。4)超声破碎4000rmp离心收集菌体，利用预冷的PBS洗涤沉淀，离心，用预冷的PBS重悬细胞，超声破碎，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取沉淀。本实施例获得以包涵体形式为主的重组蛋白。诱导温度和使用IPTG浓度对重组蛋白的分布具有很大的影响。提高温度、增加IPTG浓度可以提高表达速率，进而提高包涵体的形成。本实施例中使用较高的诱导温度和较高的IPTG浓度，可以使绝大部分重组蛋白以包涵体形式存在。实施例2：GEM纯化分离包涵体1)GEM制备利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用PBS充分洗涤，得到GEM。2)包涵体溶解将得到的包涵体沉淀利用8M尿素充分溶解，12000rmp离心，取上清即为尿素溶解包涵体溶液。3)GEM纯化分离重组蛋白将上一步得到的上清，即尿素溶解包涵体溶液与GEM混匀，室温下搅拌结合20-50分钟，12000rpm离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用GEM纯化包涵体的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建重组蛋白‑AcmA融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)8M尿素溶解包涵体；6)GEM从尿素溶解的包涵体中纯化分离重组蛋白；7)包涵体的复性；8)酶活测定。

【技术特征摘要】
1.一种利用GEM纯化包涵体的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建重组蛋白-AcmA融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)8M尿素溶解包涵体；6)GEM从尿素溶解的包涵体中纯化分离重组蛋白；7)包涵体的复性；8)酶活测定。2.根据权利要求1所述的一种利用GEM纯化包涵体的方法，其特征在于步骤1)以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，扩增得到α-淀粉酶的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。3.根据权利要求1所述的一种利用GEM纯化包涵体的方法，其特征在于步骤2)指划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.6-0.9时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.5mM-2mM，诱导温度选择为37℃，诱导时间为18小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。4.根据权利要求1所述的一种利用GEM纯化包涵体的方法，其特征在于步骤3)指利...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志江，赵芳坤，杜仁鹏，韩烨，肖华志，宋巧智，曹硕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12