猪分泌型IgA分泌片的制备与纯化复性的方法技术

本发明专利技术公开了一种猪分泌型IgA分泌片的制备与纯化复性的方法。SIgA是评价机体粘膜免疫水平的重要指标，分泌片SC是SIgA分子的特有成分，可通过SC蛋白对SIgA的含量进行评价。本发明专利技术通过摸索不同的原核表达载体和不同的宿主菌株，确定应用pET‑28a原核表达载体和Rosetta宿主菌可以使SC重组蛋白在体外大量表达，SC重组蛋白经纯化和复性后，获得了纯度较高，且能与抗天然的SIgA的多克隆抗体发生特异性结合。本发明专利技术操作简单，可获得大量纯度较高的SC蛋白，说明本发明专利技术SC蛋白具有很好的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
猪分泌型IgA分泌片的制备与纯化复性的方法
本专利技术属于重组蛋白领域，涉及猪分泌型IgA分泌片的制备与纯化复性的方法。
技术介绍
分泌型IgA(SecretoryimmunoglobulinA,SIgA)是粘膜表面的主要免疫球蛋白，它能与肠道、呼吸道等粘膜表面的病原体结合，防止病原体入侵机体。SIgA被称为防止粘膜感染的第一道防线，存在于肠道、呼吸道、泌尿道等外分泌液及初乳中，且初乳中的含量最高，生物学上SIgA含量的高低是评价机体粘膜免疫的重要指标。分泌片(Secretorycomponent，SC)是SIgA分子的重要组成部分，可用于区分SIgA和IgA,可以通过SC检测SIgA的抗体水平。目前，SC可以从初乳中分离纯化获得，但猪初乳中SC的含量较低，纯化SC的步骤繁琐、成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了猪SIgA分泌片的制备与纯化复性方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种猪分泌型IgA分泌片的制备方法，包括以下步骤：(1)提取样本RNA，反转录合成cDNA，以cDNA作为模板，使用引物进行PCR扩增反应获得扩增产物，将扩增产物切胶纯化并克隆到pMD18-T质粒上，筛选获得阳性质粒pMD18-T-SC；(2)用酶切下pMD18-T-SC质粒的SC基因片段，将SC基因片段克隆到pET-28a载体上，获得阳性的重组质粒pET-28a-SC；(3)将阳性的重组质粒pET-28a-SC转化到大肠杆菌，加入诱导剂诱导表达后收集菌体；(4)将收集的菌体洗涤、破碎、离心，收集沉淀，并洗涤、溶解、过柱纯化得到纯化后的重组蛋白；(5)将纯化后的重组蛋白置于透析溶液透析；(6)透析后将透析袋置于PBS过夜，即得猪分泌型IgA分泌片。进一步的，步骤(1)中，所述引物的核苷酸序列为：SC-F:5’-CCGGAATTCTCGGTGTCCATCAGATGCTACTA-3’(SEQIDNO:1)；SC-R:5’-ACGCGTCGACCTGCAGGTACTCCACTCCCACTA-3’(SEQIDNO:2)。进一步的，步骤(1)中，所述扩增反应体系为：进一步的，步骤(1)中，所述扩增反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃，10min。进一步的，步骤(3)中，所述的诱导剂为IPTG。进一步的，步骤(3)中，所述的大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta宿主菌的至少一种。进一步的，步骤(3)中，所述诱导为加入1mmol/L的IPTG在16℃诱导表达20小时。进一步的，步骤(4)中，所述洗涤的洗涤液pH为7.5，其含有：2M尿素，0.1MTris-HCL，1mMEDTA，1mMPMSF，0.1mMDTT和1％Triton-100。进一步的，步骤(5)中，所述透析溶液包括透析溶液A～E，并依次使用透析溶液A～E进行透析，透析溶液A～E的配方如下所示：透析溶液A含有6MUrea，50mMTris，100MmNaCl，1MmEDTA，5MmDTT；透析溶液B含有4MUrea，50mMTris，100mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT；透析溶液C含有2MUrea，50mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT，1mMGSH，0.5mMGSSG，0.2～0.4MArg；透析溶液D含有1MUrea，50mMTris，20mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT，1mMGSH，1mMGSSG，0.2～0.4MArg和5％甘油；透析溶液E含有0.5MUrea，50mMTris，10mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT，1mMGSH，1mMGSSG，0.2～0.4MArg和5％甘油。进一步的，所述的透析为依次在4℃条件使用透析溶液A～E透析10小时，透析后置于pH7.4的PBS溶液中透析过夜。上述任一项所述的方法制备的猪分泌型IgA分泌片。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对不同原核表达载体和不同宿主菌的摸索，发现本专利技术的原核表达系统可以获得大量的SC蛋白，与现有技术的猪初乳纯化分离出的SC蛋白相比，无需精密的仪器设备，操作简便，成本低廉，表达量高；本专利技术制备的包涵体洗涤液去除菌体杂蛋白的效果较好，能够除去绝大部分的杂蛋白，纯化率达到85～90％，利于进行下一步的Ni柱纯化；本专利技术制备的复性透析液降低生产成本，提高复性效率，克服了传统透析复性后复性蛋白浓度低、体积大、蛋白容易析出的缺点，透析液中加入精氨酸使透析时的蛋白浓度由0.1mg/mL～0.2mg/mL提高到2mg/mL～3mg/mL，浓度大大提高；原核表达的SC可用于制备抗SC蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，为进一步建立SIgA的检测方法及粘膜免疫的研究奠定基础。附图说明图1为SC基因扩增的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker，1为SC基因的PCR扩增结果；图2为pET28a-SC质粒(A)和pGEX-4T-1-SC质粒(B)的酶切鉴定凝胶电泳图；图3为不同载体间SC重组蛋白的表达，其中1为pET28a-SC质粒的诱导表达，2为pET28a-SC质粒未诱导，3为pGEX-4T-1-SC质粒的诱导表达，4为pGEX-4T-1-SC质粒的未诱导，M为ProteinMarker；图4为不同宿主菌间重组蛋白的表达，其中1为pET28a-SC质粒在BL21(DE3)菌株中的诱导表达，2为pET28a-SC质粒在BL21(DE3)菌株中未诱导，3为pET28a-SC质粒在Rosetta菌株中的诱导表达，4为pET28a-SC质粒在Rosetta菌株中未诱导，M为ProteinMarker；图5为SC重组蛋白分离纯化后的SDS-PAGE检测结果，其中M为ProteinMarker，1为pET28a-SC重组蛋白的纯化；图6为SC重组蛋白与抗SIgA的抗体特异性结合，其中M为ProteinMarker，1为pET28a-SC重组蛋白与抗体特异性结合的Westernblot分析，2为pET28a对照组空质粒的。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1SC蛋白原核表达重组质粒的构建1.引物的设计在NCBI网站下载野猪(Susscrofa)多聚体免疫球蛋白受体(PIGR)的基因序列，将目的基因序列运用生物信息学软件分析蛋白的信号肽、跨膜区及抗原性，根据目的基因序列，设计了大量用于SC基因PCR扩增的引物，经过大量筛选出一组灵敏度和特异性强的引物SC-F和SC-R，并且在引物SC-F和SC-R分别引入BamHI和SalI酶切位点，引物的序列如下：SC-F:5’-CCGGAATTCTCGGTGTCCATCAGATGCTACTA-3’(SEQIDNO:1)；SC-R:5’-ACGCGTCGACCTGCAGGTACTCCACTCCCACTA-3’(SEQIDNO:2)。2.SC基因片段的扩增根据RNA提取试剂盒说明书提取猪小肠组织的RNA，然后进行反转录合成cDNA，并利用高保真的DNA聚合酶扩增SC基因片段，PCR扩增的条件为：扩增反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪分泌型IgA分泌片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样本RNA，反转录合成cDNA，以cDNA作为模板，使用引物进行PCR扩增反应获得扩增产物，将扩增产物切胶纯化并克隆到pMD18‑T质粒上，筛选获得阳性质粒pMD18‑T‑SC；(2)用酶切下pMD18‑T‑SC质粒的SC基因片段，将SC基因片段克隆到pET‑28a载体上，获得阳性的重组质粒pET‑28a‑SC；(3)将阳性的重组质粒pET‑28a‑SC转化到大肠杆菌，加入诱导剂诱导表达后收集菌体；(4)将收集的菌体洗涤、破碎、离心，收集沉淀，并洗涤、溶解、过柱纯化得到纯化后的重组蛋白；(5)将纯化后的重组蛋白置于透析溶液透析；(6)透析后将透析袋置于PBS透析过夜，即得猪分泌型IgA分泌片。

【技术特征摘要】
1.一种猪分泌型IgA分泌片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样本RNA，反转录合成cDNA，以cDNA作为模板，使用引物进行PCR扩增反应获得扩增产物，将扩增产物切胶纯化并克隆到pMD18-T质粒上，筛选获得阳性质粒pMD18-T-SC；(2)用酶切下pMD18-T-SC质粒的SC基因片段，将SC基因片段克隆到pET-28a载体上，获得阳性的重组质粒pET-28a-SC；(3)将阳性的重组质粒pET-28a-SC转化到大肠杆菌，加入诱导剂诱导表达后收集菌体；(4)将收集的菌体洗涤、破碎、离心，收集沉淀，并洗涤、溶解、过柱纯化得到纯化后的重组蛋白；(5)将纯化后的重组蛋白置于透析溶液透析；(6)透析后将透析袋置于PBS透析过夜，即得猪分泌型IgA分泌片。2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物的核苷酸序列为：SC-F:5’-CCGGAATTCTCGGTGTCCATCAGATGCTACTA-3’(SEQIDNO:1)；SC-R:5’-ACGCGTCGACCTGCAGGTACTCCACTCCCACTA-3’(SEQIDNO:2)。3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩增反应体系为：4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩增反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃，10min。5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta宿主菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱利塞，贾爱卿，王贵平，钱雪桥，
申请(专利权)人：广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心，广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44