一种合成索玛鲁肽的方法技术

技术编号:20087680 阅读:81 留言:0更新日期:2019-01-15 06:50
本发明专利技术采用固相化学的方法制备索玛鲁肽,能够很好的避免杂质肽的产生,提高粗肽纯度,降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu)‑OH参与固相合成索玛鲁肽(其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde),然后脱掉保护基,在固相上脂肪酸化;同时针对索玛鲁肽工艺产生的缺1个Ala杂质肽;接18位和19位时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH,避免这一纯化过程中难以除去杂质的生成;为避免产生±Gly的工艺杂质,引入Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly–OH两个二肽作为单体参与合成;通过引入这四个个片段肽参与索玛鲁肽的固相合成,提高了粗肽纯度,降低了纯化难度,降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种合成索玛鲁肽的方法
本专利技术属多肽合成领域,特别涉及一种固相制备索玛鲁肽的方法。技术背景索玛鲁肽(Semeglutide),商品名Ozempic,由丹麦诺和诺德公司研发,于2017年12月05日在美国上市,现正在中国进行临床试验,很快将进入中国市场。Ozempic被指定为饮食和运动的辅助手段,以改善2型糖尿病患者的血糖控制。索玛鲁肽也是一种GLP-1类似物,与人GLP-1具有94%的序列同源性,是诺和诺德开发的第二代脂肪链修饰GLP-1类似物,与第一代脂肪链修饰GLP-1类似物利拉鲁肽相比,其半衰期更长,剂量更低。索玛鲁肽保持了利拉鲁肽良好的安全性和降糖有效性,且减轻体重效果优于前两者。利拉鲁肽为脂肪酸链修饰技术的第一代GLP-1类似物,修饰位点为26位赖氨酸:采用了γ谷氨酸连接子,16碳脂肪酸链,序列34位突变为精氨酸(同源性97%)。索玛鲁肽在此基础上进行了系统优化,修饰位点仍为26位赖氨酸:采用谷氨酸-2PEG为连接子,18碳二羧酸脂肪酸链,序列上34位突变为赖氨酸,8位丙氨酸突变为非天然氨基酸Aib,避免被DPP-IV酶切失活。索玛鲁肽化学表述为Aib8,Arg34Lys26-[N-ε-ODA-ODA-(γ-Glu(N-α-18-十八烷酸-1-酰基))]-GLP-1(7-37)分子式为C187H291N45O59,相对分子质量为4113.58,CAS号为910463-68-2,序列信息如下:目前,诺和诺德公司主要通过基因重组技术,利用酵母生产索玛鲁肽主链Arg34-GLP-19-37,然后连接上His-Aib;但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-19-37,还需要利用化学手段和His-Aib反应,生成索玛鲁肽主链Aib8,Arg34-GLP-17-37;然后在Lys26的侧链氨基上接上长效修饰基团。由于Aib8,Arg34-GLP-17-37的侧链及N端氨基均未保护,存在多个活性位点,所以此过程会产生较多杂质,损失较大。现有技术中,提供了合成索玛鲁肽(Semeglutide)的Fmoc化学固相合成方法。US8129343和US8536122中采用Mmt、Mtt、ivDde和Dde保护Lys26的侧链氨基,在主链完成偶联后,再脱掉侧链保护基,顺序偶联侧链长效修饰基团;CN106928344采用Alloc保护Lys26的侧链氨基,在主链完成偶联后,再利用Pd(PPh3)4脱掉保护基,顺序偶联侧链长效修饰基团;而CN106478806则采用Dde-Lys(Fmoc)-OH为合成单体,先顺序偶联完成Lys26的侧链长效修饰基团,然后再脱掉Lys26的α氨基保护基Dde,完成主链的偶联;在上述合成方法中均存在侧链修饰步骤繁多,工艺复杂,粗品的纯化难度较大等困难。专利CN108059666则采用Alloc-Lys(Fmoc)-OH为合成单体,以CTC树脂为固相载体,用固相法合成得到单体Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH,然后再作为单体固相合成得到索玛鲁肽,此办法单体的合成费用较高,导致总体合成难度增加,生产成本高。本专利技术人用现有的合成方法,制备索玛鲁肽,发现纯度和收率均不高,不适于工业规模生产。为此,本专利技术人对索玛鲁肽的合成方法进行了研究,从而得到本专利技术的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种索玛鲁肽的固相合成方法。本专利技术降低了合成难度,提高了粗肽纯度,从而降低了纯化难度,提高了收率,降低了生产成本,有利于规模化工业生产。为实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:一种固相制备索玛鲁肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:(a)采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体,用Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH与之偶联反应制备Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂,再按序列依次偶联连接保护氨基酸,得到侧链全保护的索玛鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂:Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂;(b)采用脱保护试剂脱掉20位Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu侧链谷氨酸α氨基保护基X;(c)通过固相合成法,在谷氨酸α氨基偶联十八烷二酸(OctadecanedioicAcid),得到侧链保护的索玛鲁肽肽树脂:Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-OctadecanedioicAcid)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂;(d)索玛鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得索玛鲁肽精肽。优选的,步骤(a)的具体操作步骤为:所述固相载体为替代度为0.1-0.6mmol/g的Wang树脂或CTC树脂;所述Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂脱除Fmoc保护后,以2-5倍的投料比加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应,每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应,每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点,反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc,再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应;重复操作直至合成得到侧链全保护的利拉鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂:Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。更进一步优选的,步骤(a)中,所述制备的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂替代度为0.1-0.6mmol/g,优选0.1-0.3mmol/g;所述脱保护试剂优选为20%哌啶的DMF溶液(体积比);偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOA本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种固相化学制备索玛鲁肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:(a)采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体,用Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑OH与之偶联反应制备Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂或Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑CTC树脂,再按序列依次偶联连接保护氨基酸,得到侧链全保护的索玛鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂:Boc‑His(Trt)‑Aib‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂;(b)采用脱保护试剂脱掉20位Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu侧链谷氨酸α氨基保护基X;(c)通过固相合成法,在谷氨酸α氨基偶联十八烷二酸(OctadecanedioicAcid),得到侧链保护的索玛鲁肽肽树脂:Boc‑His(Boc)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑OctadecanedioicAcid)‑OtBu)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂;(d)索玛鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得索玛鲁肽精肽。...

【技术特征摘要】
1.一种固相化学制备索玛鲁肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:(a)采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体,用Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH与之偶联反应制备Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂,再按序列依次偶联连接保护氨基酸,得到侧链全保护的索玛鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂:Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂;(b)采用脱保护试剂脱掉20位Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu侧链谷氨酸α氨基保护基X;(c)通过固相合成法,在谷氨酸α氨基偶联十八烷二酸(OctadecanedioicAcid),得到侧链保护的索玛鲁肽肽树脂:Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-OctadecanedioicAcid)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂;(d)索玛鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得索玛鲁肽精肽。2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(a)中所述固相载体Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly...

【专利技术属性】
技术研发人员:李同金赵传海孟岩周勇翟涛
申请(专利权)人:山东汉泰生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:山东,37

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