新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用。所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其氨基酸序列为：(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMS‑‑C32‑C32‑Φ‑SMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R。或(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMSRQQGESNQERGARAR‑‑C46‑C46‑Ω‑RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L。本发明专利技术的生长激素释放激素类似肽二聚体能够提高体内或体外生长激素释放活性，并具有更长的半衰期，因此具有广泛药理活性，如促进伤口愈合、促进心肌细胞重构、提高睡眠质量、促进生殖细胞的增殖和分化从而治疗不孕不育症、调节免疫、减肥和治疗糖尿病。

【技术实现步骤摘要】
新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用
：本专利技术属于医药生物领域，具体涉及多种人新型生长激素释放激素类似肽二聚体制备及其治疗中的应用。
技术介绍
：中枢性生长激素释放激素(GHRH)是一种由下丘脑释放的神经肽激素，它能特异性刺激脑垂体合成和释放生长激素(GH)，生长激素刺激肝脏等器官产生胰岛素样生长因子(IGFs)，调节机体细胞生长。hGHRH在人下丘脑中以三种形式存在：hGHRH(1-44)NH2、hGHRH(1-40)OH和hGHRH(1-37)OH。在hGHRH分子中，具有51％生物活性的短序列hGHRH(1–29)为核心肽。根据hGHRH分子特异作用于垂体产生GH机制，我们设计了通过测定体外垂体GH分泌值来确定新型hGHRH类似肽及其二聚体的体外活性。新的研究发现，外周组织的hGHRH分子与中枢性GHRH的作用机制有所不同，比如，如卵巢或睾丸，这些外周组织也含有GHRH、GHRH受体和GH分子信号，但是它们不一定因为GHRH分子的刺激产生特异自分泌GH，一些新型外源性GHRH类似肽或其二聚体分子的体内注射会产生生殖细胞GHRH受体上调增加受孕率，而不会促进垂体GH和生殖细胞GH的增加，显示受试动物的生殖与GH没有直接的关系。在体外，这类肽的体外垂体保温会诱导特异垂体GH的分泌。因此，通过测定受试动物体内血GH、体外垂体分泌GH值和用代表性GHRH二聚体测定受试动物的怀孕率，可以明显反应垂体GH、靶细胞GH信号与动物生殖能力和对外源性GHRH的反应特征：即在不影响GH的情况下，这些GHRH肽明显提高受孕率。外周注射发现的这个新药理机制突破了传统中枢性GHRH-GH-IGFs轴，显示这类肽在治疗上有新的可能性。这类GHRH肽具有广泛药理活性，如促进伤口愈合、促进心肌细胞重构、提高睡眠质量、促进生殖细胞的增殖和分化从而治疗不孕不育症、调节免疫、减肥和治疗糖尿病等。虽然hGHRH类似物在生物医学和农学领域有着巨大的应用潜在，但是它们的短半衰期或低活性限制了它们的应用。结构-活性关系表明，N-末端1Tyr是hGHRH体内垂体GH释放高活性所必需的，N端序列是活性的主要来源。随着序列向C端延伸，其活性和半衰期都逐渐增加。当GHRH分子的N端两个氨基酸残基被血中氨基二肽酶切除，剩余片段活性降低到原来的千分之一，这就是hGHRH分子降解的根源。天然hGHRH(1-44)OH的半衰期为13分钟，GHRH类似物的C端聚乙二醇化可增加分子稳定性和延长半衰期，但是活性也明显降低。到目前为止，hGHRH(1–44)NH2是这些类似物中活性最强的。许多蛋白质前体在内质网内需要与长脂肪链结合，增加成熟加工能力，或分布在细胞膜、内质网膜或高尔基体膜等部位的一些蛋白质分子会通过长脂肪酸链锚定到这些膜相系统上，以增加定位能力。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一类用于治疗不孕不育的生长激素释放激素类似肽二聚体。所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其氨基酸序列为：(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMS--C32-C32-Φ-SMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R。或(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMSRQQGESNQERGARAR--C46-C46-Ω-RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L。上述大写单字母为L-ɑ-氨基酸的缩写或氨基酸取代符号，阿拉伯数字为氨基酸残基排列顺序，NH2代表N末端或者C端酰胺基结构，半胱氨酸残基C32或C46的C末端为-COOH或CONH2；其中X1为Y或P；X12为K、A，或R；X21为具有K侧链ε氨基【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰，其结构式如式1所示，其中n＝3-22，或K侧连ε氨基的烷酸基修饰，其中n＝3-22，其结构式如式2所示：上述氨基酸序列中的大写字母为氨基酸的简写，这属于公知常识。其中NH2代表氨基位于N端或者C端酰胺基结构，OH代表羧基COOH位于C端，这也属于本领域的公知常识。本专利技术通过实验发现，所述的生长激素释放激素类似肽二聚体可提高体外或/和体内生长激素释放活性，具体如下：1.体外生长激素释放活性：S-D雌鼠(体重200±20g)购自广州中医药大学实验动物中心，所有实验动物的护理和使用制度与实验动物指导方针一致。在饲养中，大鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。大鼠经过脱臼猝死，在30分钟摘取脑垂体。用灭菌的lactatedRinger’sbuffer(LRB)冲洗后，垂体立即放到内有1mlLRB的1×10cm玻璃管中，37℃保温。所有的玻璃管总保温5h(P1,P2,I3,I4和I5，代表5小时保温的不同时段，每个时段代表1小时)，同时每5min轻轻晃动一次。每1小时后，全部吸出缓冲液进行垂体GH激素测试，同时加入1毫升新鲜的不带有或带有GHRH类似肽的LRB到该垂体中保温。在前2小时(P1和P2)预保温后，随后在第3小时保温(I3、I4和I5)中，开始增加活性多肽。净GH释放水平为(I3+I4+I5)-P2，未加肽的P2做为空白对照和人天然hGHRH(1-44)NH2(S肽)做为阳性对照。大鼠垂体生长激素通过使用RatGrowthHormoneELISA试剂盒(MilliporeCo.,USA)进行测试。2.体内生长激素释放活性：昆明雌性小鼠(体重18-22g)购自广州中医药大学实验动物中心。所有实验动物的护理和使用制度与动物饲养实验指导方针一致。在饲养中，小鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。小鼠后腿肌肉注射1.92μmol/kg的肽，每种肽三只动物(n＝3),经过1小时，內眦取血,测定血清GH。实验中，注射生理盐水做空白对照和人天然S肽做阳性对照。小鼠GH激素通过使用RatGrowthHormoneELISA试剂盒(MilliporeCo.,USA)进行测试。3.活性结果汇总：体外垂体GH释放活性：(1)与标准S肽[人天然hGHRH(1-44)NH2]比较，具有N末端Y或P的GHRH类似肽二聚体显示了至少2倍以上的GH释放活性，N末端Y的GHRH二聚体肽释放GH值明显高过N末端P的GHRH二聚体；(2)虽然具有C末端C或GC，GGC延伸的GHRH二聚体类似肽GH释放值没有统计学差异，但是-GGC延伸显示更高释放值；(3)N末端为Y或P的30-33肽单体形成的二聚体肽的活性仅是45-47肽单体形成的二聚体肽的50％左右。体内GH释放活性：(1)带有Y1--R12K13--K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-烷酸基)]}修饰或烷酸修饰的序列和C末端为COOH的二聚体肽显示了成倍高的GH释放活性；(2)N末端带有P的各种二聚体肽没有显示统计学上增高的GH释放活性；(3)C末端-COHN2的二聚体肽没有显示统计学上增高的GH释放活性；(4)带有K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-烷酸基)]}修饰的序列显示了比带本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生长激素释放激素类似肽二聚体，其特征在于，氨基酸序列为：(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMS‑‑C32‑C32‑Φ‑SMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R；或(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMSRQQGESNQERGARAR‑‑C46‑C46‑Ω‑RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L；上述大写单字母为L‑ɑ‑氨基酸的缩写或氨基酸取代符号，阿拉伯数字为氨基酸残基排列顺序，NH2代表N末端或者C端酰胺基结构，半胱氨酸残基C32或C46的C末端为‑COOH或CONH2；其中X1为Y或P；X12为K、A，或R；X21为具有K侧链ε氨基【γ‑Glu(N‑α‑烷酸基)】修饰，其结构式如式1所示，其中n＝3‑22，

【技术特征摘要】
1.生长激素释放激素类似肽二聚体，其特征在于，氨基酸序列为：(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMS--C32-C32-Φ-SMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R；或(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMSRQQGESNQERGARAR--C46-C46-Ω-RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L；上述大写单字母为L-ɑ-氨基酸的缩写或氨基酸取代符号，阿拉伯数字为氨基酸残基排列顺序，NH2代表N末端或者C端酰胺基结构，半胱氨酸残基C32或C46的C末端为-COOH或CONH2；其中X1为Y或P；X12为K、A，或R；X21为具有K侧链ε氨基【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰，其结构式如式1所示，其中n＝3-22，或K侧连ε氨基的烷酸基修饰，其中n＝3-22，其结构式如式2所示：2.根据权利要求1所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其特征在于，其为：(NH2)YADAIFTNSYRKVLGQLSARK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-LLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(HO)CGGLRARAGREQNSEGQQRSMIDQLLK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-RASLQGLVKRYSNTFIADAY(NH2)；或(NH2)YAD...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐松山，张旭东，谭宏梅，唐婧晅，罗群，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44