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靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽制造技术

技术编号:20087668 阅读:27 留言:0更新日期:2019-01-15 06:50
本发明专利技术涉及一种靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽,属于生物医药技术领域;本发明专利技术以表皮细胞生长因子EGF为靶分子,经噬菌体展示技术的淘选,以EGF为有效成分特异性洗脱结合靶分子的噬菌体得到生物活性多肽TUZG20;经本发明专利技术证实,该生物活性多肽TUZG20显著抑制了由EGF引起的胃癌细胞增殖过程;本发明专利技术多肽序列较短,易于合成和实现规模化生产,能抑制EGF的促癌作用,具备后续开发成为抗癌药物的潜力,在抗癌药物研发方面具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽
本专利技术属于生物医药
,涉及一种靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽。
技术介绍
EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是表皮生长因子受体家族成员之一,广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥着重要的作用。表皮细胞生长因子(EGF,EpidermalGrowthFactor)是人体内的一种活性细胞因子,通过结合其受体EGFR来刺激细胞的生长、增殖与分化过程。EGF本是一种6kD分子量大小的蛋白质,具有53个氨基酸残基和三个分子内二硫键,等电点4.6,对热稳定,是目前已知的最稳定的蛋白质之一。在无配体结合状态下,EGFR以单体的形式存在于细胞膜表面。当表皮生长因子受体EGFR结合EGF等配体后,可刺激EGFR的同源或异源二聚化,激活受体的内在蛋白酪氨酸激酶活性,而酪氨酸激酶的活化又可启动信号转导级联反应,导致细胞内多种生物化学变化,例如:细胞内钙水平升高,糖酵解和蛋白质合成增加,以及包括EGFR在内的某些基因表达增加等现象,最终导致DNA合成和细胞增殖。胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,大量研究表明,EGFR表达量与胃癌组织的分化程度呈正相关,EGFR的表达水平越高表明肿瘤的恶性程度越高。肿瘤细胞在丝裂原的刺激下,旁/自分泌大量的EGF,促进肿瘤细胞及正常细胞分裂增殖,形成恶性循环。胃癌的病情进展缓慢但持续发展,大多数胃癌患者在最初诊断时已有大量的转移性扩散,这也是胃癌预后不佳的一个主要原因,有研究表明,EGF能够促进胃癌细胞发生上皮-间质转化,有助于肿瘤细胞浸润和转移。EGF及EGFR的表达与胃癌的分化程度、浸润和转移密切相关,是胃癌治疗的潜在靶点。因此,以EGFR为靶点,通过干扰EGF/EGFR介导的信号传导,来达到抑制肿瘤的增殖、侵袭等目的,为胃癌分子靶向治疗的新思路。目前,针对EGFR的肿瘤分子靶向药物,按其性质主要分为两大类:一类是单克隆抗体,目前在我国已上市的有西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等,但是单克隆抗体存在生产成本较高的问题;另一类是小分子抑制剂,已上市的有吉非替尼、厄洛替尼和拉帕非尼等,但是小分子抑制剂的毒副作用较强,用药后患者不良反应较多。EGFR信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用,因而靶向EGFR药物已成为肿瘤治疗的热点。近年来,多肽类药物已成为药物研发的热点之一,大多数多肽以细胞外分子为靶点,多肽药物具备生物活性高,特异性强,毒性反应相对较弱,在体内不易产生蓄积,与其他药物的相互作用比较少,与体内受体的亲和性较好等众多优点。噬菌体展示技术是一种筛选功能性短肽的新型生物技术,是一种将编码多肽的外源基因或随机序列的DNA分子群与负责表达噬菌体外壳蛋白的基因相互融合后,使外源DNA所编码的蛋白质以融合蛋白形式表达在噬菌体外壳表面的方法。被展示的多肽或蛋白可在噬菌体的表面保持相对的空间结构和生物活性。通过噬菌体展示技术可以经多轮的“亲和,洗脱,扩增”步骤,实现高通量亲和筛选。噬菌体展示技术是一种简便、有效、易于控制的用于表达外源基因的操作系统,实现了表型和基因型的统一,具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的EGFR靶向多肽,具体提供一种由噬菌体展示技术筛选得到的以EGFR为靶点的具有抗肿瘤活性的多肽。本专利技术提供一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽,所述多肽为TUZG20,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示,具体序列信息为:SEQ.ID.NO.1:SerAlaIleHisPheHisHisProArgTrpLysPro。其中,所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖;优选的,所述肿瘤细胞为胃癌细胞;优选的,所述胃癌细胞为AGS细胞。本专利技术还提供所述抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。其中,优选的,所述肿瘤为胃癌。本专利技术还提供一种用于治疗或预防肿瘤的靶向药物,所述药物包括权利要求1所述的多肽;优选的,所述肿瘤为胃癌。本专利技术首先将靶标EGFR-ECD的基因导入了原核表达载体pET-30a中,使带有载体上标签的重组蛋白EGFR-ECD大量表达,并从包涵体中纯化得到目的蛋白。将EGFR-ECD包被固定,使噬菌体(随机十二肽噬菌体文库NEB(北京)有限公司)与之结合,以EGFR的配体EGF竞争洗脱特异性结合靶分子的噬菌体,经过4轮淘选,富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增之后提取DNA,对其进行测序,并合成了出现频率较高的多肽TUZG20。经细胞MTT法对多肽进行体外活性的验证,结果表明多肽TUZG20对EGF促进胃癌细胞AGS增殖具有抑制作用,其氨基酸序列为:SerAlaIleHisPheHisHisProArgTrpLysPro。本专利技术的有益效果:本专利技术是以EGFR为靶标筛选得到的能够和EGF竞争性结合EGFR并且抑制EGF促进细胞增殖的多肽。本专利技术筛选的多肽与单克隆抗体药物相比制作成本较低;与小分子抑制剂药物相比特异性强,毒性反应相对较弱。本专利技术中以胃癌细胞为模型细胞,验证了多肽TUZG20具有显著抑制EGF促进肿瘤细胞生长的活性,使之具有成为抗肿瘤药物的临床价值。专利技术的多肽序列短,易于实现规模化生产,具有广阔的市场前景。附图说明图1为原核表达蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列;其中阴影部分为(His)6标签,下划线部分为目的蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列。图2为构建的蛋白表达载体pET-30a/EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果;其中图A为1%琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD的PCR扩增产物;图B为重组质粒pET-30a/EGFR-ECD的双酶切验证;其中M为DNAmarker标记,1为pET-30a空载体的BamHI、EcoRI的双酶切结果,2为EGFR-ECD的BamHI、EcoRI的双酶切结果,3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。图3为重组蛋白EGFR-ECD在BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果;其中图A为超声破碎后未离心的菌液,其中M是蛋白marker标记,1为转化pET-30a空载体的转化子,2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体;图B为超声破碎并离心后的上清液,其中M是蛋白marker标记,1为转化pET-30a空载体的转化子,2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子;C为蛋白透析复性结果,其中1为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液,2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子离心后的沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。图4为EGF敏感性胃癌细胞株的筛选结果;其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响;B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响;C为EGF对AGS细胞存活率的影响。图5为多肽TUZG20的活性验证结果;图中“-”表示未加入对应物质,“+”表示加入对应物质;*,P<0.01;**,P<0.05。具体实施方式实施例1:pET-30a/EGF本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽,其特征在于,所述多肽氨基酸序列为:Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro。

【技术特征摘要】
1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽,其特征在于,所述多肽氨基酸序列为:SerAlaIleHisPheHisHisProArgTrpLysPro。2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖。3.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述肿瘤细胞为胃癌细胞。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员:屠志刚李濡妍刘晗青卢子文徐涵任德万
申请(专利权)人:江苏大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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