一种纯化制备抗菌肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化制备抗菌肽的方法和装置，解决了现有技术中抗菌肽纯化时，无法使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。本发明专利技术包括制取合成气的方法和装置，其中，方法包括：步骤一、制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。本发明专利技术能够能使半透膜纯化和反向色谱法纯化相互促进，使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化制备抗菌肽的方法
本专利技术涉及提纯领域，具体涉及一种纯化制备抗菌肽的方法。
技术介绍
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽，通过作用于细菌细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，进入细胞内，破坏其细胞器引起代谢紊乱。细菌内容物泄出细胞外使细菌死亡。抗菌肽不仅对细菌、真菌有较好的杀菌作用，它也有抗病毒活性、促进伤口愈合的作用。同时，抗菌肽与溶菌酶联用还具有协同抗菌作用。在这两种核心成分的作用下，形成对致病菌双重破壁杀菌作用。抗菌肽类似于国外临床试验的MSI-78，该品种已完成三期临床，用于糖尿病溃疡的治疗。目前，很少有关于其分离纯化方面的研究报道，特别是规模化生产的方法。抗菌肽常用的纯化方法包括反相高效液相色谱法、凝胶法、离子交换法等，采用任何一种单一方法或者多种手段，都很难分离得到高纯度产品(＞99％)，或者收率较低(＜50％)。在CN201511014180.X中公开了一种合成卡贝缩宫素的纯化方法，该文件中已经公开了采用半透膜纯化和反向色谱法纯化相结合工艺，确保成品符合纯度大于99％，单个杂质小于0.1％的药用原料药标准。虽然其公开了可以使多肽纯化后的纯度大于99％，单个杂质小于0.1％的效果。但是，通过检测得知，将该方法应用到抗菌肽中时，依然无法使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种纯化制备抗菌肽的方法，其通过工艺步骤和参数的合理优化，能使半透膜纯化和反向色谱法纯化相互促进，使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。本专利技术通过下述技术方案实现：一种纯化制备抗菌肽的方法，包括：步骤一、抗菌肽粗品通过纯化水溶解后过滤制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；该反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。现有技术中公开了一种通过半透膜纯化和反向色谱法纯化相互结合的纯化方法，其目的是提高成品的纯度，使纯度达到99.5％以上。基于上述问题，专利技术人通过实验验证得知：采用该文件中半透膜纯化和反向色谱法纯化相互结合的方法对抗菌肽纯化后，虽然能很好的提高抗菌肽的纯度，使纯度达到99.5％以上，但是实际上抗菌肽的收率提高并不显著，甚至并没有提高，其可以通过对照例的结果对照得知。而为了提高抗菌肽的收率，本行业技术人员通常通过优化纯化过程中的参数条件来提高纯化后的收率和纯度。但是在实际过程中，由于纯化的物质不同，采用的纯化方法和条件不同，其纯化效果也不尽相同。对于多肽而言，当采用反向液相色谱法进行纯化的方法时，当纯化后的纯度达到99.5％以上时，其收率往往低于50％，甚至低于40％，收率低、成本高，并不满足产业化的要求。本专利技术通过采用半透膜纯化和反向色谱法纯化相互结合后，进一步优化了反向液相色谱法中的反相色谱条件，在抗菌肽成品的纯度达到99.5％以上时，同时使抗菌肽成品的收率高于50％，效果十分显著。另外，本专利技术中的半透膜透析纯化操作简单，无需特殊设备，半透膜可以重复使用，极大的降低了成本；同时对精纯反相色谱填料提供了很好的保护作用，延长了色谱填料的更换周期和使用寿命，相应的降低了反相色谱精纯阶段的成本。本专利技术采用半透膜技术进行初步纯化，无需浓缩即可进行色谱纯化，减少高温浓缩步骤，降低了抗菌肽高温降解几率。进一步，所述步骤二的过程为：首先，将抗菌肽粗品溶液装入到半透膜中，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝2.0～3.0；然后将含抗菌肽溶液的半透膜转移至纯化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.5～4.5。进一步，所述缓冲液与抗菌肽粗品溶液的体积比为(10～40)：1；所述纯化水与抗菌肽溶液的体积比为(50～60)：1。进一步，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH值为3.5。进一步，所述半透膜为纤维素酯膜或再生纤维素膜，截留分子量为500道尔顿。进一步，所述通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。进一步，所述减压浓缩过程中浓缩条件为不超过35℃，真空度为0.08Mpa以上。进一步，所述干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50～-10℃保持2～4小时，使真空度恒定在0.01～1.00mbar，升温干燥12～36小时。进一步，所述抗菌肽粗品由液相合成法或固相合成法合成。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本专利技术充分发挥了各自纯化技术的优点，显著的提高了目标纯度，可制备出纯度大于99.5％，单个杂质小于0.1％的药用原料药，突破了现有的高纯度的瓶颈；2、本专利技术因透析的效果减少了精纯次数和步骤，缩短了纯化工艺路线，节约了成本；3、本专利技术极大的提高了纯化效率和收率，其纯度高于99.5％时纯化收率大于50％，更加适合于产业化生产，效果更加显著。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为实施例1中纯化后样品检测图谱。图2为实施例1中纯化后样品高分辨质谱图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例1一种纯化制备抗菌肽的方法，包括：(1)样品处理：采用固相合成法获得色谱纯度达50％以上的抗菌肽粗肽，用纯化水按照50g/L的浓度溶解，搅拌，完全溶解后用0.45um的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得到滤液，滤液干燥后即为抗菌肽粗品。(2)初纯：在160g抗菌肽粗品中加入3.2L纯化水，配置成50mg/ml抗菌肽粗品溶液，然后用微孔滤膜过滤，得到抗菌肽粗品溶液备用。将抗菌肽粗品溶液装入截留分子量为500道尔顿的RC半透膜中，约总容量体积的60％，至于32L醋酸盐缓冲液中，室温下搅拌渗透。将含抗菌肽溶液半透膜转移至160L的纯化水中，在20～30℃下搅拌渗透后取出，得到抗菌肽初纯溶液备用。(3)精纯反相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的高效液相色谱制备柱，柱子的粒径10um，孔径100A。柱子直径和长度为：80x250mm。流动相中A相为：10mM硫酸铵，通过硫酸调整pH至2.0；流动相中B相为：乙腈；流速：320ml/min；梯度：10％～40％，检测波长：220nm；单次上样量约16g。色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡，将所得抗菌肽初纯溶液上样，单次上样量约16g。线性梯度洗脱60min，收集目标峰，根据HPLC分析检测定量，将收集的抗菌肽于水温35℃以下的条件下减压旋蒸浓浓缩至乙腈大部分被旋出，得到抗菌肽精纯溶液备用。(4)转盐：将所得抗菌肽精纯溶液，减压浓缩后，采用HPLC换盐法，即醋酸铵和醋酸通过离子交换转盐；将转盐后的合格馏分合并，进行减压浓缩至0.5g/50ml，浓缩温度不超过35℃，然后冷冻干燥获得纯度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化制备抗菌肽的方法，其特征在于，包括：步骤一、抗菌肽粗品通过纯化水溶解后过滤制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；该反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。

【技术特征摘要】
1.一种纯化制备抗菌肽的方法，其特征在于，包括：步骤一、抗菌肽粗品通过纯化水溶解后过滤制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；该反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。2.根据权利要求1所述的一种纯化制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤二的过程为：首先，将抗菌肽粗品溶液装入到半透膜中，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝2.0～3.0；然后将含抗菌肽溶液的半透膜转移至纯化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝3.5～4.5。3.根据权利要求2所述的一种纯化制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述缓冲液与抗菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：高剑，夏平安，钟国庆，龙小芳，冯智辉，张佳丽，李元波，
申请(专利权)人：成都诺和晟泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51