一种分离纯化鼠李糖脂的方法技术

本发明专利技术涉及到一种分离纯化鼠李糖脂的方法，采用离心的方法去除菌体，收集上清液，然后将收集的上清液，加入发酵液体积10%乙醇沉淀蛋白，采用离心的方法去除沉淀的蛋白，收集上清液，加入磷酸调节pH使鼠李糖脂析出，产生沉淀；之后经过离心收集鼠李糖脂沉淀。最后向石油醚中打撒鼠李糖脂沉淀，让鼠李糖脂均匀的分散于石油醚中，溶解鼠李糖脂中的杂质，离心收集沉淀得到提纯的鼠李糖脂。采用本发明专利技术的方法最终鼠李糖脂回收率为91.82%，鼠李糖脂纯度为85%。与现有的技术相比，本发明专利技术的方法具有操作简单，回收率高，无毒安全的特点，是一种工艺简单，适合工业化的批量生产的简便，经济，高效的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化鼠李糖脂的方法
本专利技术涉及到一种分离纯化方法，尤其是鼠李糖脂的分离纯化方法。
技术介绍
鼠李糖脂是目前研究较多的一种生物表面活性剂，具有乳化、增溶和降低界面张力等功能，且低毒、易生物降解，在石油化工、生物医药、食品卫生及环境保护等领域有良好应用前景。然而鼠李糖脂的分离成本制约着其使用成本，因为鼠李糖脂的下游分离成本通常占其生产成本的60%。目前关于鼠李糖脂的分离多处于实验室阶段，很少有形成工业化的规模。目前对鼠李糖脂的研究多集中于提高产率上及其应用效果上，在提取工艺方面的研究较少。现有的工艺主要包括萃取法，活性炭吸附法，这些方法都不同程度的存在着一些缺陷。Zhao等使用氯仿甲醇体系萃取，氯仿和甲醇是具有很强毒性的化学品，随着生产的放大，安全隐患也逐渐增高，并且使用氯仿等试剂处理过的鼠李糖脂无法用于化妆品和食品行业，产品质量得不到保障。任方旭等使用活性炭吸附鼠李糖脂活性炭对鼠李糖脂没有选择性，使得分离过程效率低，而且活性炭价格偏高，会造成分离成本过高。
技术实现思路
本方法目的就在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、经济、高效的鼠李糖脂分离纯化方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案来实现：一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将鼠李糖脂发酵液置于离心管中离心富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；（2）在步骤（1）收集的发酵液上清液中加入无水乙醇；（3）将步骤（2）中加入无水乙醇的发酵液上清液加入磁力搅拌子，放置于磁力搅拌器上搅拌；（4）将（3）中搅拌处理后的溶液置于离心管中离心富集沉淀蛋白，收集去除蛋白的上清液，即去除蛋白的鼠李糖脂发酵液；（5）在（4）中收集的去除蛋白的鼠李糖脂发酵液中加入磷酸调节pH使鼠李糖脂析出，产生沉淀，静置一段时间；（6）将（5）中产生沉淀的发酵液置于离心管中离心富集鼠李糖脂沉淀，舍弃上清液，将产生的沉淀烘干，得到鼠李糖脂沉淀产品；（7）将（6）中得到的鼠李糖脂沉淀产品均匀的打撒于石油醚中，溶解鼠李糖脂中的杂质；（8）将（7）中石油醚和鼠李糖脂沉淀产品混合物置于离心管中离心，使固液分离，收集鼠李糖脂固体，得到提纯的鼠李糖脂产品。本专利技术的方法，所述步骤（1）中，将鼠李糖脂发酵液在10000rpm，4℃条件下离心20min。所述离心管为50mL尖底离心管。所述步骤（2）中，无水乙醇的添加量为鼠李糖脂发酵液体积的10%。所述步骤（3）中，搅拌的条件为250rpm搅拌9h。所述步骤（4）、步骤（6）和步骤（8）中，将鼠李糖脂发酵液在6000rpm，4℃条件下离心10min。所述步骤（5）中所用的磷酸为分析纯级别磷酸；加磷酸调节pH至2，在4℃下静置18h。所述步骤（7）中，鼠李糖脂沉淀产品和石油醚的质量体积比为1/2~1/8（w/v）。本专利技术利用蒽酮硫酸法检测鼠李糖脂浓度，取步骤（1）发酵液上清液、步骤（4）去除蛋白的鼠李糖脂发酵液、步骤（6）酸沉淀后的上清液和步骤（8）固液分离后的石油醚洗涤液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂损失率。与现有的技术相比，本专利技术结合乙醇沉淀蛋白，磷酸沉淀鼠李糖脂，石油醚提纯鼠李糖脂，可以很好得到纯度较高鼠李糖脂，重复性良好。该方法克服了现有技术中存在的危险性大，回收率低，产品品质差等缺陷，是一种工艺简单，适合工业化批次生产的简便、经济、高效的鼠李糖脂分离纯化方法。附图说明图1为实施例1的分析结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实例对本专利技术进行详细说明。实施例1一种分离纯化鼠李糖脂的方法，该方法主要包含以下步骤：（1）将520mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于12个50mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃离心20min，小心收集上清液。（2）将步骤（1）中收集的上清液倒入量筒中，准确量体积测得剩余体积为500mL，加入10%无水乙醇共50mL。（3）将（2）中加入无水乙醇的发酵液倒入1000mL烧杯中，加入磁力搅拌子，加入的磁力搅拌子为四氟磁力搅拌子A型，将烧杯放到磁力搅拌器上搅拌9h，设置转速为150rpm。（4）将（3）中处理结束的发酵液均匀分装于12个50mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并倒入量筒中量体积。测得剩余体积为525mL，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。（5）将（4）中收集到的鼠李糖脂发酵液缓慢加入磷酸，边加边搅拌，调节pH至2，在4℃放置18h。（6）将（5）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃离心10min，准确量得上清液体积为505mL，舍弃上清液，将产生的沉淀放入105℃烘箱中，烘干称重，共得26.15g粗鼠李糖脂，测得纯度为65.45%。（7）将（6）中的粗鼠李糖脂加入到200mL石油醚中，使用快速混匀机打散鼠李糖脂固体，直至鼠李糖脂均匀分散于石油醚中。（8）将（7）中的鼠李糖脂和石油醚使用低温高速离心机6000rpm，4℃离心10min，来进行固液分离，收集鼠李糖脂沉淀，放入105℃烘箱中，烘干称重，共得18.5g鼠李糖脂，测得纯度为85%。收集石油醚洗涤液，量取体积为200mL。利用蒽酮硫酸法检测鼠李糖脂浓度变化。取定量去蛋白前后、酸沉淀前后的发酵液和提纯后的石油醚洗涤液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。测得步骤（1）中上清液的鼠李糖脂浓度为33.76g/L，测得步骤（4）中去蛋白后发酵液鼠李糖脂浓度为31.82g/L，乙醇沉淀蛋白工艺的鼠李糖脂回收率为98.99%，测得步骤（6）中上清液的鼠李糖脂浓度为1.04g/L，酸沉淀鼠李糖脂的鼠李糖脂回收率为96.89%，测得步骤（8）中石油醚洗涤液中鼠李糖脂浓度为4.25g/L，石油醚纯化法的鼠李糖脂回收率为91.82%，综上，该方法在较高回收率的前提下，可得纯度很高的鼠李糖脂。实施例2一种分离纯化鼠李糖脂的方法，该方法主要包含以下步骤：（1）将520mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于12个50mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃离心20min，小心收集上清液。（2）将步骤（1）中收集的上清液倒入量筒中，准确量体积测得剩余体积为500mL，加入10%无水乙醇共50mL。（3）将（2）中加入无水乙醇的发酵液倒入1000mL烧杯中，加入磁力搅拌子，加入的磁力搅拌子为四氟磁力搅拌子A型，将烧杯放到磁力搅拌器上搅拌9h，设置转速为150rpm。（4）将（3）中处理结束的发酵液均匀分装于12个50mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并倒入量筒中量体积。测得剩余体积为525mL，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。（5）将（4）中收集到的鼠李糖脂发酵液缓慢加入磷酸，边加边搅拌，调节pH至2，在4℃放置18h。（6）将（5）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃离心1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将鼠李糖脂发酵液置于离心管中离心富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；（2）在步骤（1）收集的发酵液上清液中加入无水乙醇；（3）将步骤（2）中加入无水乙醇的发酵液上清液加入磁力搅拌子，放置于磁力搅拌器上搅拌；（4）将（3）中搅拌处理后的溶液置于离心管中离心富集沉淀蛋白，收集去除蛋白的上清液，即去除蛋白的鼠李糖脂发酵液；（5）在（4）中收集的去除蛋白的鼠李糖脂发酵液中加入磷酸调节pH使鼠李糖脂析出，产生沉淀，静置一段时间；（6）将（5）中产生沉淀的发酵液置于离心管中离心富集鼠李糖脂沉淀，舍弃上清液，将产生的沉淀烘干，得到鼠李糖脂沉淀产品；（7）将（6）中得到的鼠李糖脂沉淀产品均匀的打撒于石油醚中，溶解鼠李糖脂中的杂质；（8）将（7）中石油醚和鼠李糖脂沉淀产品混合物置于离心管中离心，使固液分离，收集鼠李糖脂固体，得到提纯的鼠李糖脂产品。

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将鼠李糖脂发酵液置于离心管中离心富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；（2）在步骤（1）收集的发酵液上清液中加入无水乙醇；（3）将步骤（2）中加入无水乙醇的发酵液上清液加入磁力搅拌子，放置于磁力搅拌器上搅拌；（4）将（3）中搅拌处理后的溶液置于离心管中离心富集沉淀蛋白，收集去除蛋白的上清液，即去除蛋白的鼠李糖脂发酵液；（5）在（4）中收集的去除蛋白的鼠李糖脂发酵液中加入磷酸调节pH使鼠李糖脂析出，产生沉淀，静置一段时间；（6）将（5）中产生沉淀的发酵液置于离心管中离心富集鼠李糖脂沉淀，舍弃上清液，将产生的沉淀烘干，得到鼠李糖脂沉淀产品；（7）将（6）中得到的鼠李糖脂沉淀产品均匀的打撒于石油醚中，溶解鼠李糖脂中的杂质；（8）将（7）中石油醚和鼠李糖脂沉淀产品混合物置于离心管中离心，使固液分离，收集鼠李糖脂固体，得到提纯的鼠李糖脂产品。2.根据权利要求1所述的一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，将鼠李糖脂发酵液在10000rpm，4℃条件下离心20min。3.根据权利要求1所述的一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述离心管为尖底离心管。4.根据权利要求1所述的一种分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，薛瑞，周杰，姜岷，徐宁，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32