一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法，该种荧光探针与半胱氨酸发生选择性反应，丙烯酰基断裂，得到荧光基团，荧光信号开启，实现对半胱氨酸的选择性检测；荧光基团受强的电子给、受体系影响，分子内电荷转移作用非常明显，能同时得到长波长的荧光发射和较大的斯托克斯位移，继而有效降低背景干扰信号，提高成像质量，本发明专利技术提供的荧光探针发射波长为636nm，斯托克是位移为158nm，具有选择性强、灵敏度高和成像优异的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及化学分析
，具体涉及一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法。
技术介绍
细胞内广泛存在着三种小分子硫醇类氨基酸，包括半胱氨酸，同型半胱氨酸和谷胱甘肽，它们参与了大量重要的生物过程。其中，半胱氨酸在蛋白质的合成、新陈代谢和解毒作用等过程中扮演了非常重要的角色，并且与很多疾病的发生息息相关，如生长迟缓、水肿、肝损伤，心血管疾病和阿尔兹海默病等。同时，这三种硫醇氨基酸在结构上有相似的地方，因此，在活细胞中选择性地检测半胱氨酸有很大的意义并且很有挑战性，将会对一些疾病的辅助诊断及预后提供有价值的信息。荧光探针具有实时监测、操作方便和无创伤检测等优势，在生物检测领域引起了广泛的关注和研究。目前已见报道的半胱氨酸的荧光探针大多数发射波长较短，背景信号干扰强；少数探针发射红光或者近红外光，但是斯托克斯位移又太小，自吸收现象严重，以致于探针效果较差。因此，亟需一种荧光发射波长较长，斯托克斯位移较大的，选择性好，灵敏度高的半胱氨酸荧光探针。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法，该种探针选择性好、灵敏度高。本专利技术提出一种适用于半光氨酸的荧光探针，具有如下所示的结构式：。一种适用于半光氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、将反应物加入到反应容器中；（2）、再向反应容器中加入缚酸剂和溶剂，低温滴加丙烯酰氯后，在该温度下保温10-30min；（3）、保温后，将反应容器置于室温下反应，得到反应产物；（4）、将所述反应产物纯化后，得到一种适用于半胱氨酸的荧光探针；该荧光探针的合成路线如下：。在细胞环境中，半胱氨酸的巯基能与该探针丙烯酰基中的双键进行亲核取代反应，同时半胱氨酸的氨基能对该丙烯酰基的羰基发生进攻，从而将丙烯酰基以七元环内酰胺的形式从探针分子中断裂下来，从而恢复荧光基团的荧光发射，实现对半胱氨酸的选择性检测。进一步地，反应需在惰性气体保护下进行。进一步地，所述缚酸剂为三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙基胺，哌啶和吡啶中的一种或多种。进一步地，所述溶剂为有机溶剂。进一步地，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氢呋喃、乙腈、苯和甲苯中的一种或多种。进一步地，步骤（2）中低温滴加温度为-5-5℃。进一步地，步骤（3）中反应时间为0.5-5h。进一步地，所述反应物、丙烯酰氯和缚酸剂的投料摩尔比为1:1-1.5:1-3。进一步地，步骤（4）中采用硅胶柱层析法进行纯化。本专利技术的一种适用于半光氨酸的荧光探针及其制备方法，该种荧光探针与半胱氨酸发生选择性反应，丙烯酰基断裂，得到荧光基团，荧光信号开启，实现对半胱氨酸的选择性检测；荧光基团受强的电子给、受体系影响，分子内电荷转移作用非常明显，能同时得到长波长的荧光发射和较大的斯托克斯位移，继而有效降低背景干扰信号，提高成像质量，本专利技术提供的荧光探针发射波长为636nm，斯托克是位移为158nm，具有选择性强、灵敏度高和成像优异的特点。附图说明图1为本专利技术荧光探针的[C25H17N3O3Na]+质谱图；图2为本专利技术荧光探针干扰性对比及选择性测试结果示意图；图3为本专利技术荧光探针对MCF-7活细胞内半胱氨酸的荧光成像图。具体实施方式为下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外，本领域技术人员对本专利技术所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本专利技术实施例中的配比均为以重量计。实施例1请参照图1。氩气保护下，反应物（0.31g,0.85mmol）和三乙胺（0.09g,0.90mmol）加入到双口烧瓶中，加入二氯甲烷（10mL）做溶剂，将烧瓶放入冰盐水浴中，温度为-5℃，然后缓慢滴加丙烯酰氯（0.07g,0.82mmol）的二氯甲烷（3mL）溶液，滴完后保温10分钟，移去冰水浴，室温反应0.5小时。旋蒸除掉溶剂，用硅胶柱层析分离提纯，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇（35/1，v/v）。得到探针0.25g，收率81%。ESI-HRMS:[M+Na]+,[C25H15NO4Na]+,Calculated:416.0899;Found:416.0892。实施例2氩气保护下，反应物（0.24g,0.66mmol）和三乙胺（0.13g,1.32mmol）加入到双口烧瓶中，加入二氯甲烷（10mL）做溶剂，将烧瓶放入冰水浴中，温度为0℃，然后缓慢滴加丙烯酰氯（0.09g,0.99mmol）的二氯甲烷（3mL）溶液，滴完后保温20分钟，移去冰水浴，室温反应2小时。旋蒸除掉溶剂，用硅胶柱层析分离提纯，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇（35/1，v/v）。得到探针为0.23g，收率85%。ESI-HRMS:[M+Na]+,[C25H15NO4Na]+,Calculated:416.0899;Found:416.0890。实施例3氩气保护下，反应物（0.55g,1.51mmol）和三乙胺（0.44g,4.52mmol）加入到双口烧瓶中，加入二氯甲烷（10mL）做溶剂，将烧瓶放入冷水浴中，温度为5℃，然后缓慢滴加丙烯酰氯（0.20g,2.26mmol）的二氯甲烷（3mL）溶液，滴完后保温30分钟，移去冰水浴，室温反应5小时。旋蒸除掉溶剂，用硅胶柱层析分离提纯，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇（35/1，v/v）。得到探针0.62g，收率82%。ESI-HRMS:[M+Na]+,[C25H15NO4Na]+,Calculated:416.0899;Found:416.0886。实施例4测定本专利技术所得荧光探针检测的抗干扰性及选择识别能力。通过本专利技术所得的荧光探针分别进行干扰性测试，其中Vc为维生素C，H2O2为双氧水，t-BuOOH为叔丁基过氧化氢，NaClO为次氯酸钠，Gly为甘氨酸，Glu为谷氨酸，His为组氨酸，Pro为脯氨酸，Lys为赖氨酸，Na2S为硫化钠，GSH为谷胱甘肽，Hcy为同型半胱氨酸，Cys为半胱氨酸。从图2中可以看出在存在不同的干扰试剂下，探针对半胱氨酸具有较强的选择性以及抗干扰能力。实施例5为了考察本专利技术荧光探针对细胞内半胱氨酸（Cys）的检测性能，我们将探针用于活细胞内半胱氨酸的荧光成像实验。如附图3所示，6组实验分别为：对照组（MCF-7细胞）；MCF-7细胞用探针培养40分钟；MCF-7细胞用Cys培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用Hcy培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用GSH培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用NEM（N-乙基马来酰亚胺，一种硫醇氨基酸的清除剂）培养1小时后，再用探针培养40分钟；其中，探针的浓度为10μM，Cys，Hcy，GSH浓度分别为100μM，NEM浓度为1mM。激发波长488nm，荧光收集波长为600-700nm，比例尺20μm。跟控制组相比，经探针培养的细胞可见明亮的红色荧光。而且，仅当细胞经半胱氨酸（Cys）培养后，荧光会明显增强；经同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）培养后，荧光强度几乎不变。当细胞内的硫醇氨基酸被NEM清除后，荧光强度基本消失。可见，探针对硫醇氨基酸有选择性响应，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于半光氨酸的荧光探针，其特征在于，具有如下所示的结构式：

【技术特征摘要】
1.一种适用于半光氨酸的荧光探针，其特征在于，具有如下所示的结构式：。2.如权利要求1所述的一种适用于半光氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、将反应物加入到反应容器中；（2）、再向反应容器中加入缚酸剂和溶剂，低温滴加丙烯酰氯后，在该温度下保温10-30min；（3）、保温后，将反应容器置于室温下反应，得到反应产物；（4）、将所述反应产物纯化后，得到一种适用于半胱氨酸的荧光探针；该荧光探针的合成路线如下：。3.如权利要求2所述的一种适用于半光氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：反应需在惰性气体保护下进行。4.如权利要求2所述的一种适用于半光氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述缚酸剂为三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙基胺，哌啶和吡啶中的一种或多种。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈杜刚，党耶城，陈莉，余响林，
申请(专利权)人：武汉工程大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42