酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用，属微生物农药技术领域。其特点是通过发酵培养保藏登记号为CCTCC NO：M 2018221的一株链霉菌（Streptomyces sp.）YIM PH20246，再对其发酵产物进行萃取浓缩及分离纯化，得到2种酚嗪生物碱类次生代谢产物。本发明专利技术的酚嗪生物碱类次生代谢产物对三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌均具有不同程度的抑制活性。本发明专利技术的酚嗪生物碱类次生代谢产物具有抑菌效果好，易重复生产，经济安全、绿色环保的优点，能作为制备拮抗三七根腐病剂的应用。

【技术实现步骤摘要】
酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用
本专利技术涉及一种酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用，属微生物农药

技术介绍
三七的种植和加工是云南省生物医药产业发展的重要支柱，由于三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境非常容易诱发各种土传微生物病害，其中以尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和黄瓜萎蔫病菌等真菌引起的根腐病害最为严重。目前对三七根腐病的防治很大程度上还是依赖于使用有机氯、有机磷以及氨基甲酸酯等化学农药进行药剂灌根，但长期使用化学农药易导致病害产生抗药性和环境被污染，且由于农药的大量使用所导致的三七农药残留已严重地影响了三七的品质和药用价值。目前国内外对生物农药的研制给予了极大重视，生物防治被认为是农业病害防治中最具有发展潜力的防治方法。通过大量筛选和利用拮抗三七根腐病的有益微生物及其产生的活性次生代谢物进行三七根腐病害的防治，具有经济安全、绿色环保的优势，是三七根腐病防治中重要而有效的途径。获得结构明确的活性先导化合物不仅有利于知识产权的保护和产品的登记，还可使农药在生产过程中实现有效的质量控制，因此，从微生物次生代谢产物中发现活性先导化合物是绿色新型微生物农药研发的关键之一。经国内外文献检索，目前没有与本专利技术相同的酚嗪生物碱类化合物应用于防治三七根腐病的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是从YIMPH20246菌株的次生代谢产物中获得具有抑制三七根腐病病原真菌活性的单体化合物，为新型微生物抑制三七根腐病剂的研发奠定物质基础。本专利技术是这样实现的：专利技术人在前期研究中，筛选得到一株具有抑制三七根腐病活性的链霉菌YIMPH20246（Streptomycessp.YIMPH20246），该菌株已于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2018221。本专利技术采用菌株种子液体培养及菌株液体发酵培养的方法，对YIMPH20246菌株进行二级发酵培养，发酵结束后将发酵液离心除去菌丝体，发酵上清液用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干溶剂浓缩得到菌株发酵粗提物。菌株发酵粗提物经过硅胶柱层析(氯仿/甲醇洗脱)分离后得到五个组分，其中的活性组分采用反复Sephedex-LH20凝胶柱(甲醇)和硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯洗脱)的方法进一步分离纯化，即得到本专利技术的2个酚嗪生物碱类活性单体化合物。经质谱、红外、紫外光谱、旋光及核磁共振波谱数据分析，确定了这2个化合物结构。其中，化合物1为9-hydroxyphenazine-1-carboxamide，化合物2为methyl9-carbamoylphenazine-1-carboxylate，它们均为未见文献报道的新结构化合物。化合物1（1）及化合物2（2）的化学结构如式（I）所示。从菌株YIMPH20246的发酵产物中分离纯化得到的2个酚嗪生物碱类单体化合物的理化性质及化合物的质谱、红外、紫外光谱、旋光及1H谱、13C谱数据结果如下：化合物1：桔红色粉末，旋光值-58.5185(c0.30，MeOH)，紫外吸收UV(MeOH)lmax(loge):207(4.59),249(4.34),266(4.59),368(3.86),436(3.36)，红外吸收IR(KBr)nmax：3431,2961,2923,2851,1624,1582,1559,1535,1473,1399,1164,1129,974,867,719cm-1，质谱HR-ESIMSm/z：240.0768[M+H]+，262.0576[M+Na]+，238.0632[M-H]-，分子量为239，分子式为C13H9N3O2。其1H谱、13C谱数据为：1HNMR(600MHz,CD3OD,d,ppm,J/Hz)：8.85(1H,dd,J=7.08,1.26,H-2),8.53(1H,dd,J=8.64,0.96,H-4),8.02(1H,dd,J=8.52,7.26,H-3),7.89(1H,dd,J=8.76,7.62,H-7),7.81(1H,t,J=7.74,H-6),7.26(1H,dd,J=7.32,0.54,H-8)。13CNMR(150MHz,CD3OD,d,ppm)：169.15(CONH2),154.84(C-9),144.04(C-4a),142.98(C-5a),142.39(C-10a),137.06(C-1),136.63(C-4),135.51(C-2),134.73(C-3),130.66(C-7),130.36(C-9a),120.40(C-6),111.92(C-8)。化合物2：黄色粉末，旋光值-36.2963(c0.45,DMSO)，紫外吸收UV(DMSO)lmax(loge):257(4.43),369(4.13),393(3.66),红外吸收IR(KBr)nmax：3431,2950,2925,2853,1732,1674,1655,1631,1617,1533,1453,1435,1384,1340,1259,1216,1038,854,755,671,568cm-1，质谱HR-ESIMSm/z：282.0873[M+H]+，分子量为281，分子式为C15H11N3O3。其1H谱、13C谱数据为：1HNMR(600MHz,DMSO-d6,d,ppm,J/Hz)：8.70(1H,dd,J=7.02,1.38,H-2),8.60(1H,dd,J=8.70,1.20,H-8),8.41(1H,dd,J=8.64,1.32,H-6),8.30(1H,dd,J=6.84,1.26,H-4),8.11(1H,dd,J=8.64,7.08,H-7),8.09(1H,dd,J=6.06,4.26,H-3),4.01(3H,s,CH3)。13CNMR(150MHz,DMSO-d6,d,ppm)：166.61(CONH2),165.64(COOCH3),142.73(C-10a),140.78(C-4a),140.30(C-5a),139.66(C-9a),134.65(C-6),133.21(C-4),132.67(C-2),132.05(C-8),131.71(C-9),131.26(C-1),131.10(C-7),130.92(C-3),52.70(COOCH3)。对照文献(J.Antibiot.,1995,48,1353-1354.)报道的核磁数据，化合物1鉴定为9-hydroxyphenazine-1-carboxamide；化合物2鉴定为methyl9-carbamoylphenazine-1-carboxylate。采用常规MIC法实验测定本专利技术的酚嗪生物碱类化合物对4株三七根腐病病原真菌的抑制活性，以最小抑制浓度（MIC）值表征活性结果，所得结果如表（1）所示。表（1）本专利技术的酚嗪生物碱类化合物抗三七根腐病病原真菌活性：MIC法实验表明：本专利技术的酚嗪生物碱类化合物对三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌均具有不同程度的抑制活性。化合物1对尖孢镰刀菌及黄瓜萎蔫病菌的抑菌活性最好，其最小抑制浓度均为32μg/mL；化合物2对草茎点霉菌的抑菌活性最好，其最小抑制浓度为32μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于抑制三七根腐病病原真菌的酚嗪生物碱类次生代谢产物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：a.生产菌株链霉菌YIM PH20246（Streptomyces sp. YIM PH20246）已于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO ：M 2018221 ；b.酚嗪生物碱类次生代谢产物由2种化合物组成，其结构式为：

【技术特征摘要】
1.用于抑制三七根腐病病原真菌的酚嗪生物碱类次生代谢产物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：a.生产菌株链霉菌YIMPH20246（Streptomycessp.YIMPH20246）已于2018年4月19日保藏于中国典型培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一青，胡林芳，赵立兴，苗翠苹，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53