一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法技术

技术编号:20087419 阅读:51 留言:0更新日期:2019-01-15 06:36
本发明专利技术公开了一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法。本发明专利技术以4‑(3‑甲基‑2‑萘酰胺基)丁酸为喹乙醇代谢物半抗原,该半抗原与载体蛋白后偶联可以得到喹乙醇代谢物抗原,所述喹乙醇代谢物抗原可应用于制备喹乙醇代谢物特异性抗体,该特异性抗体又可用于制备检测食品中喹乙醇代谢物残留的酶联免疫试剂盒或者胶体金试纸卡。本发明专利技术还公开了相应的试剂盒检测方法。该方法简便、快速,其线性检测范围为0.2~16.2 ng/mL,灵敏度为0.54 ng/mL,检出限为0.32 ng/mL,回收率为80%~109.8%,检出限低、灵敏度高、特异性强、稳定性好,成本低,非常适合大量样品检测及现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法
本专利技术属于药品残留检测
更具体地,涉及一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法。
技术介绍
喹乙醇是喹噁啉类药物的早期产品,20世纪70年代以来,曾在全世界范围内广泛应用,但目前被全世界禁用于食品动物促生长作用。欧洲联盟于1998年禁止卡巴氧和喹乙醇的使用,我国禁止将喹乙醇和卡巴氧用于食品动物促生长,并规定动物组织中喹乙醇残留标示物的最大残留限量。近年,喹乙醇药物主要在澳大利亚、巴西、日本及中国等地使用。喹乙醇对动物体产生的毒性主要包括急性毒性和蓄积毒性。喹乙醇摄入过量会使动物应激性大量出血而死亡,在动物体内蓄积到一定程度时也会对动物或人产生致畸、致癌、致突变的“三致作用”。因此,使用时,必须严格按其使用范围、剂量浓度实行休药期。鉴于喹乙醇的毒性和存在的潜在危害,因而人们重新对喹乙醇的安全性进行评价,对喹乙醇的使用也做出了新的规定。喹乙醇本身不稳定,其在动物体内短时间代谢有十多种代谢产物,大部分不具备检测条件,其中3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQCA)是主要代谢物,在体内相对稳定,是国家食品法典委员会认定的标示残留物,因此通常将喹乙醇代谢物MQCA作为残留分析和监控的目标物。2003年我国农业部规定了肌肉和肝脏组织中MQCA的最大残留量分别为4μg/kg和50μg/kg。然而,喹乙醇药物在生产实践中依然被大量非法使用或滥用,药物的残留对消费者健康和动物性食品出口造成巨大潜在威胁,从而带动相关检测方法的研究。这些检测方法有液相色谱-质谱法、液相色谱法、气相方法、酶联免疫法、胶体金吸附检测法、分子印迹和生物传感器方法等。其中,液相色谱-质谱法和酶联免疫法为主流分析方法。与之相比,免疫分析法因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低,成为值得推广常用的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足,提供一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法。该酶联免疫试剂盒具有准确、灵敏、快速、能够高通量检测喹乙醇代谢物的优点,能够高效检测喹乙醇代谢物,为喹乙醇代谢物快速检测产品的开发提供了一定的理论指导,对药品安全的监控具有重要意义。本专利技术的第一个目的是提供一种喹乙醇代谢物半抗原。本专利技术的第二个目的是提供应用上述喹乙醇代谢物半抗原制备得到的喹乙醇代谢物抗原。本专利技术的第三个目的是提供上述喹乙醇代谢物抗原在制备喹乙醇代谢物抗体中的应用。本专利技术的第四个目的是提供应用上述喹乙醇代谢物抗原制备得到的喹乙醇代谢物抗体。本专利技术的第五个目的是提供上述喹乙醇代谢物抗体在检测喹乙醇代谢物中的应用。本专利技术的第六个目的是提供应用上述喹乙醇代谢物半抗原、喹乙醇代谢物抗原、喹乙醇代谢物抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。本专利技术的第七个目的是提供应用上述酶联免疫试剂盒进行检测样品中喹乙醇代谢物残留的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现:本专利技术涉及一种喹乙醇代谢物半抗原,所述半抗原为4-(3-甲基-2-萘酰胺基)丁酸,其分子结构式如式(1)所示:式(1)。所述半抗原4-(3-甲基-2-萘酰胺基)丁酸的制备方法,包括以下步骤:将3-甲基-2-萘酸溶解在SOCl2中,在氮气保护下加热至90~110℃反应1~3h;减压除去溶剂,将残余物溶解在1,4-二噁烷中,在搅拌条件下,将其滴加至氨基酸和Na2CO3的混合水溶液中;室温搅拌过夜,加入盐酸溶液酸化后,用EtOAC进行萃取,合并有机相后,用饱和NaCl溶液洗涤、干燥后,采用硅胶柱层析纯化得到4-(3-甲基-2-萘酰胺基)丁酸,即为所述半抗原。本专利技术还涉及一种喹乙醇代谢物抗原,是将所述的喹乙醇代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到。其中,所述载体蛋白可为鼠血清白蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白或纤维蛋白原等常用载体蛋白。优选地,所述载体蛋白为卵清蛋白。所述喹乙醇代谢物抗原的制备方法为:采用活泼酯方法,将所述半抗原(4-(3-甲基-2-萘酰胺基)丁酸)与载体蛋白偶联,即可得到喹乙醇代谢物抗原。所述喹乙醇代谢物抗原可以作为免疫原制备喹乙醇代谢物抗体,也可以作为包被原制备酶标板。所述抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体,优选为单克隆抗体。所述的喹乙醇代谢物多克隆抗体的制备方法如下:将上述喹乙醇代谢物抗原作免疫原免疫兔子或小鼠,制备喹乙醇代谢物多克隆抗体,最后收集抗血清,用辛酸硫酸镀沉淀纯化及过亲和层析柱进行纯化。所述的喹乙醇代谢物单克隆抗体的制备方法如下:将上述喹乙醇代谢物抗原作免疫原免疫小鼠,用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养,获得含高浓度单克隆抗体的腹水,并对腹水纯化得到高特异性抗喹乙醇代谢物单克隆抗体。相应地,应用所述喹乙醇代谢物抗原制备得到的抗体及其在检测喹乙醇代谢物中的应用,也在本专利技术的保护范围之内。应用所述喹乙醇代谢物半抗原、所述喹乙醇代谢物抗原、所述喹乙醇代谢物抗体制备得到的酶联免疫试剂盒或胶体金试纸卡,也在本专利技术的保护范围之内。优选地,所述的酶联免疫试剂盒,含有:包被有喹乙醇代谢物抗原的酶标板、喹乙醇代谢物抗体、酶标二抗、喹乙醇代谢物系列标准品溶液、底物缓冲液与底物工作液、浓缩洗涤液、终止液、复溶液和硫酸溶液。优选地,所述包被喹乙醇代谢物抗原的包被液为:将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到;喹乙醇代谢物抗原的包被浓度为0.125μg/L。优选地,所述酶标板可为96孔可拆透明酶标板,材质为聚苯乙烯,包被有能与抗喹乙醇代谢物抗体特异性结合的喹乙醇代谢物抗原,并封闭微孔表面未吸附喹乙醇代谢物抗原的位点。所述包被有喹乙醇代谢物抗原的酶标板的制备方法为:用包被液将喹乙醇代谢物抗原按需要稀释,向孔中加入包被液,放入37℃环境进行孵育过夜,倾去包被液,用洗涤液洗涤,然后在每孔中加入封闭液,37℃孵育,倾去孔内液体,干燥后用铝膜真空密封保存。本文中的过夜是指8~16h。其中在酶标板制备过程中,所用封闭液是将0.1gBSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mLPBS(0.01mol/L,pH为7.4)溶液得到。另外,可以作为固定喹乙醇代谢物抗原固相载体的物质较多,例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酷胶、交联葡萄糖、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠等。优选地,所述酶标二抗为羊抗兔IgG。酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶,优选为辣根过氧化物酶。优选地,所述喹乙醇代谢物系列标准品溶液,在使用时用0.2mol/L、pH为5.4的磷酸盐缓冲液,将喹乙醇代谢物标准品溶液稀释成浓度分别为0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2ng/mL的一系列喹乙醇代谢物标准品溶液。更优选地,所述磷酸盐缓冲液的配方为:2.9g的NaH2PO4·12H2O、8.5g的NaCl、0.2g的KCl、0.2g的KH2PO4,定容至1L。优选地,所述底物工作液为pH为4.5~5.5,含有过氧化氢或过氧化脲的磷酸-柠檬酸缓冲液;所述底物缓冲液为pH为4.5~5.5,含有3,3,5,5-本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种喹乙醇代谢物半抗原,其特征在于,所述半抗原为4‑(3‑甲基‑2‑萘酰胺基)丁酸,其分子结构式如式(1)所示:

【技术特征摘要】
1.一种喹乙醇代谢物半抗原,其特征在于,所述半抗原为4-(3-甲基-2-萘酰胺基)丁酸,其分子结构式如式(1)所示:式(1)。2.一种喹乙醇代谢物抗原,其特征在于,是将权利要求1所述的喹乙醇代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到。3.权利要求2所述喹乙醇代谢物抗原在制备喹乙醇代谢物抗体中的应用。4.应用权利要求2所述喹乙醇代谢物抗原制备得到的喹乙醇代谢物抗体。5.权利要求4所述喹乙醇代谢物抗体在检测喹乙醇代谢物中的应用。6.应用权利要求1所述喹乙醇代谢物半抗原、权利要求2所述喹乙醇代谢物抗原、权利要求4所述喹乙醇代谢物抗体制备得到的酶联免疫试剂盒或胶体金试纸卡。7.权利要求6所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,含有:包被有喹乙醇代谢物抗原的酶标板、喹乙醇代谢物抗体、酶标二抗、喹乙醇代谢物系列标准品溶液、底物缓冲液与底物工作液、浓缩洗涤液、终止液、复溶液和硫酸溶液。8.根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述底物工作液为pH为4.5~5.5,含有过氧化氢或过氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨金易沈玉栋曾道平谭庶孙远明陈丽韦田
申请(专利权)人:华南农业大学广东温氏食品集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

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