干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒技术

技术编号:20043060 阅读:38 留言:0更新日期:2019-01-09 03:30
本发明专利技术公开了干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒。采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液,在内标品中加入干血斑萃取液,混匀直至完全溶解,真空干燥制成内标品液,将内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液,利用工作液萃取待测滤纸片进行振荡孵育,采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。本发明专利技术的检测方法高通量、高敏感、简单易行,可用于筛查新生儿X连锁肾上腺脑白质营养不良(XALD)症,也可以用于辅助诊断,增加新生儿遗传代谢疾病的筛查种类,给与及时诊断,使患儿得以及时治疗,减少出生缺限儿童的患病率。

Detection of Lysophosphatidylcholines in dried blood tablets and its kit

The invention discloses a method for detecting Lysophosphatidylcholines in dry blood tablets and a kit thereof. Dry blood spot extract was obtained by extracting dry blood spot with extract liquid. Dry blood spot extract was added to the internal standard, mixed until completely dissolved. The internal standard liquid was prepared by vacuum drying. The internal standard liquid was diluted into working liquid by dry blood spot extract. The filter paper to be tested was extracted by working liquid and incubated by oscillation. The Lysophosphatidylcholines in samples were detected by tandem mass spectrometry. The detection method of the present invention has the advantages of high throughput, high sensitivity, simplicity and practicability, and can be used for screening X-linked adrenoleukodystrophy (XALD) of newborns, as well as for assistant diagnosis, increasing the types of screening for genetic and metabolic diseases of newborns, providing timely diagnosis, enabling children to be treated in time and reducing the morbidity of children with birth limitation.

【技术实现步骤摘要】
干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及生化检测设备
,尤其涉及一种流动进样-串联质谱法筛查滤纸干血片中多种溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC)浓度的定量检测技术及试剂盒。
技术介绍
新生儿遗传代谢病的筛查(NeonatalScreening,简称新筛)是对一些危害儿童生命、导致儿童体格及智能发育障碍的先天性、遗传性疾病进行筛查,以便作出早期诊断,在临床症状未表现之前或表现轻微时得以早期治疗,防止机体组织器官发生不可逆的损伤,避免患儿发生严重智力低下、严重疾病甚至死亡。串联质谱法(TandemMassSpectrometry,MS/MS)是新筛的一个有用的检测工具,能在几分钟内对一个滤纸干血片样本进行几十种代谢产物分析,实现了“一次实验检测多种疾病”的要求,使新筛在内容和质量上都提高到一个新水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒。为实现上述技术目的,本专利技术采用如下技术方案:一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱;22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱;所述方法包括如下步骤:(1)制备内标品液:采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液,在内标品中加入干血斑萃取液,混匀直至完全溶解,真空干燥制成内标品液;(2)制备工作液:将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液;(3)利用打孔器将待测滤纸片、质控品滤纸片打孔,放入V截底型96孔板中,之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液;将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育;(4)振荡结束后,取孵育溶液,采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。本专利技术的方法,所述步骤(1)中,内标品成分为d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱。所述萃取液为含有0.05%甲酸的80:20甲醇水溶液。所述步骤(2)中,将内标品溶液用干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液;稀释后内标品浓度为4μmol/L。所述步骤(3)中,将96孔板密封放入孵育振荡器内,在温度为45℃±5℃、振荡频率为650-750转/分的条件下,振荡孵育45分钟。所述质控品包括低水平质控及高水平质控品,低水平质控品为含1μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片;高水平质控品为含5μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片。所述步骤(4)中,通过多反应监控MRM模式检测,质谱条件见下表:表1溶血磷脂酰胆碱类检测质谱条件分析物母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压(V)碰撞能量(eV)20:0溶血磷脂酰胆碱552104503022:0溶血磷脂酰胆碱580104503024:0溶血磷脂酰胆碱608104503026:0溶血磷脂酰胆碱6361045030本专利技术还提供了一种检测干血片中溶血磷脂酰胆碱类的试剂盒,所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱;22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱;所述试剂盒包括:(1)萃取液:含有0.05%甲酸的80:20甲醇水溶液;(2)内标品:d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱;(3)质控品,所述质控品为含有已知浓度的20:0溶血磷脂酰胆碱;22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的滤纸干血片,包括高水平质控品和低水平质控品。进一步的,所述高水平质控品浓度为5μmol/L,低水平质控品浓度为1μmol/L。所述试剂盒还可包括V截底型96孔板、V型96孔板、微孔板粘贴膜、铝箔制微孔板封套、质量分析报告和产品说明书。本专利技术的检测原理是在已知浓度的相应内标品存在下,新生儿滤纸干血片中的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱被样本前处理试剂萃取,萃取样本经过处理后,经由进样器和微型泵进入到质谱仪的离子源,形成带电均匀喷雾,离子被导入质谱第一级质量过滤器中,按质荷比大小而被分离后进入碰撞室,被碰撞激活解离,较小的子代离子随后被导入第二级的质量过滤器,在此按质荷比进行分离,而后送到检测器内通过选择性反应监控(SRM)等模式得到离子信号。每种分析物的信号强度与相应内标品的响应程度成正比例,从而计算出滤纸干血片中的分析物浓度。数据采集与分析处理由质谱仪系统内的软件自动执行。本专利技术采用串联质谱(MS/MS)技术,来实现对滤纸干血片中20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的定量检测,检测结果可以辅助临床医生诊断患者是否有溶血磷脂酰胆碱代谢相关的疾病,用于筛查新生儿X连锁肾上腺脑白质营养不良(XALD)症,也可以用于辅助诊断,提高新生儿筛查的疾病种类,及时诊断新生儿遗传代谢病,使患儿得以及时治疗,减少出生缺乏儿童的发生率。本专利技术的串联质谱法筛查滤纸干血片中20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱浓度的定量检测技术及试剂盒,可以使准确地检测各类型滤纸干血片中的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱浓度,其结果能够有效筛查和诊断新生儿和儿童多种多样遗传代谢病。附图说明图1为本专利技术实施例的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱内标品质谱检测图;上图为4种溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱同位素内标品的多反应监测质谱图,下图为4种溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱同位素内标的总离子流图。图2为本专利技术实施例的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱内标品质谱检测离子流图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下通过具体实施例并参见附图,对本专利技术进行详细说明。实施例中,滤纸干血片样本的采集方法参考《新生儿疾病筛查技术规范》中《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》。合格滤纸干血片标准如下:(1)每一样本至少3个血斑,且每个血斑直径均大于8毫米。(2)血滴自然渗透,滤纸正反面血斑一致。(3)血斑无污染。(4)血斑无渗血环。(5)有完整的干血斑片采集信息记录。实施例使用仪器:超高效液相色谱-串联质谱仪(WatersACQUITYUPLCI-ClassIVD/WatersXevoTQ-DIVDSystem,USA);微孔板振荡器(货号2000A011,质谱生物科技有限公司产品);V截底型96孔板(货号2000F01,质谱生物科技有限公司);V底型96孔板(货号2001F01,质谱生物科技有限公司);1/8英寸(3.2mm)打孔器(货号2001A011,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱;22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱;所述方法包括如下步骤:(1)制备内标品液:采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液,在内标品中加入干血斑萃取液,混匀直至完全溶解,真空干燥制成内标品液;(2)制备工作液:将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液;(3)利用打孔器将待测滤纸片、质控品滤纸片打孔,放入V截底型96孔板中,之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液;将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育;(4)振荡结束后,取孵育溶液,采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。

【技术特征摘要】
1.一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱;22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱;所述方法包括如下步骤:(1)制备内标品液:采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液,在内标品中加入干血斑萃取液,混匀直至完全溶解,真空干燥制成内标品液;(2)制备工作液:将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液;(3)利用打孔器将待测滤纸片、质控品滤纸片打孔,放入V截底型96孔板中,之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液;将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育;(4)振荡结束后,取孵育溶液,采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。2.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中,内标品成分为d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱。3.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中,萃取液为含有0.05%甲酸的80:20甲醇水溶液。4.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中,将内标品溶液用干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液;稀释后内标品浓度为4μmol/L。5.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法,其特征在于,所述步骤(3)中,将96孔板密封放入孵育振荡器内,在温度为45℃±5℃、振荡频率为650-750转/分的条件下,振荡孵育45分钟。6.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员:邹敏旭刘辉宇张瑞雪王猛
申请(专利权)人:质谱生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:山东,37

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