鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法技术

技术编号:20038124 阅读:24 留言:0更新日期:2019-01-09 01:34
本发明专利技术公开了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。所述酶切位点为ACACGT。该方法首先获取待测目标样品并反转录成cDNA,以所获得的cDNA为模板加入引物对进行RT‑PCR扩增,扩增得到PCR产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析,确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株;当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时,使用AflIII酶对PCR产物进行酶切,确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。本发明专利技术的RT‑PCR检测敏感度可达到1×10

Identification of the restriction site and its method of YN144 of the variant attenuated strain of porcine epidemic diarrhea virus

The invention discloses an enzyme cut site and a method for identifying the variant YN144 of porcine epidemic diarrhea virus. The cleavage site is ACACACGT. First, the target sample was obtained and then transcribed to cDNA, and the cDNA was used as template. Primers were used to amplify the RT PCR and the PCR product was amplified. Then the agarose gel electrophoresis method was used to determine whether it was a variant strain of porcine epidemic diarrhea virus. When the target sample was porcine epidemic diarrhea virus variant strain, the PCR product was digested by AflIII enzyme. To determine whether the variant strain is YN144, a variant of porcine epidemic diarrhea virus. The RT PCR detection sensitivity of the present invention can reach 1*10.

【技术实现步骤摘要】
鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法
本专利技术涉及生物毒株鉴别
,具体涉及一种鉴定鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)是引起我国仔猪腹泻的重要病原,影响我国养猪业的发展,给猪场造成了巨大损失。各日龄猪均易感,哺乳仔猪感染率和病死率最高。在仔猪中以引起呕吐、脱水、水样腹泻和严重的肠炎为主要特征(刘政龙等,2015)。2010年,PEDV变异毒株引起的PED在我国暴发,由于经典疫苗对流行的变异毒株的保护力不够,导致我国规模化养殖场陆续出现仔猪严重腹泻,大量死亡的情况(LiWTetal.,2012,SunRQetal.,2012)。目前,我国流行的主要PEDV毒株为变异毒株,占比90%以上,成为危害我国养猪业重要病原之一。由于PEDV毒株之间的交叉保护力不一样,毒株类型影响疫苗免疫效果,因此PEDV变异弱毒疫苗的研发和其对应的鉴别方法的建立对于PED疫苗的推广、使用以及PED的防控具有重要意义。2013年本实验室分离到一株变异毒株,命名YN1(GenBankNO:KT021227),经过Vero细胞上连续传代至144代,获得了一种来源于高度适应细胞的毒株YN144(GenBankNO:KT021232)。通过动物实验证实已适应细胞的15代病毒YN-15(GenBankNO:KT021228.1)仍为强毒力野毒株,而YN-144为致弱毒株(ChenFZetal.,2015),随后对变异弱毒YN144进行了临床评估,证明该毒株安全性和对变异毒株引起的PED有很好的保护性,可作为疫苗候选株(刘洋,2016)。目前检测PEDV的经典疫苗毒株(CV777)的RT-PCR方法有很多,但还没有鉴别PEDV变异弱毒的检测方法。经典疫苗毒株(CV777)的鉴别是根据ORF3基因连续缺失49个核苷酸的特点,在基因缺失两端设计引物,通过RT-PCR方法扩增,所得到的经典疫苗毒株(CV777)ORF3基因片段比经典野毒少49bp,从而可鉴别出PEDV经典野毒与CV777疫苗株(李长龙等2014)。目前猪场流行的PEDV的毒株主要为变异毒株,而来源于变异毒株的疫苗比经典毒株疫苗能提供更好的保护力,因此变异毒株和变异弱毒疫苗的鉴别在免疫与监测上至关重要。YN144为致弱的变异毒株,具有较好的安全性和临床应用效果(刘洋,2016),是比较理想的弱毒疫苗候选株,因此,建立区分变异弱毒株YN144诊断方法,对于YN144推广使用和PED防控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点及其方法。本研究通过比对分析传代致弱株YN144与强毒株YN15以及其他变异毒株的序列,找到YN144在S1基因存在“AACAGGT”6个碱基的连续缺失,缺失两端可形成AflIII酶切位点(ACACGT)。因此本研究结合RT-PCR和酶切方法,建立鉴别变异弱毒YN144的方法,为新疫苗推广和使用提供了鉴别诊断的技术,从而更好指导疫苗使用,防控PED。为实现上述目的,本专利技术设计了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点,所述酶切位点为ACACGT。本专利技术还提供了一种获得含有上述酶切位点的序列片段的引物对,所述引物对为:V-F:5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’,如SEQIDNo.1所示;V-R:5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’,如SEQIDNo.1所示;其中,合并碱基R为A/G,合并碱基Y为C/T。本专利技术还提供了一种鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法,包括以下步骤:1)获取待测目标样品;2)提取待测目标样品的RNA;3)RNA反转录成cDNA;4)以所获得的cDNA为模板加入引物对进行RT-PCR扩增,扩增得到PCR产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析,确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株;5)当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时,使用AflIII酶对PCR产物进行酶切,确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。进一步地,所述步骤4)中,引物对为V-F:5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’,V-R:5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’;其中,合并碱基R为A/G,合并碱基Y为C/T。再进一步地,所述步骤4)中,若电泳观测到大小为720bp,即确定待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株;否之,即确定待测目标样品不是猪流行性腹泻病毒变异毒株。再进一步地,所述步骤5)中,若PCR产物被酶切为523bp和197bp两条片段时,确定变异毒株为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144;否之,确定变异毒株不为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。再进一步地,所述步骤4)中,RT-PCR反应体系为反应体系:2×EsTaqMasterMix12.5μL,上游引物V-F1μL(10μM),下游引物V-R1μL(10μM),去离子水6.5μL,DNA模板4μL;RT-PCR反应条件为94℃5min;95℃35s,58.4℃35s,72℃30s,30个循环;72℃延伸10min。再进一步地,所述步骤5)中,酶切反应体系:25μL酶切体系为:0.5μL(5U)AflIII酶,0.5μgDNA,2.5μL10×NEBuffer;酶切反应条件:酶切管置于37℃水浴锅中反应1~2h。本专利技术的有益效果:(1)本专利技术针对我国目前流行的猪流行性腹泻病毒变异毒株易变基因S序列特点设计了特异性的引物,建立了可扩增变异毒株的RT-PCR方法,该方法敏感性好,对PEDV变异毒株的检出下限为1×100.7TCID50/100μL,对构建的标准质粒可检测到1.27×103copies/μL。该方法可特异性扩增变异毒株得到720bp目的条带,与猪的其他重要病原无交叉反应,该方法可以用于临床检测PEDV变异毒株,为临床上采取针对性的措施,预防和控制PED提供参考。(2)本专利技术弥补现有猪流行性腹泻病毒学鉴定和诊断的技术不足,现有的检测方法不能区分变异弱毒株YN144。本专利技术建立的酶切方法,可达到同时快速鉴别变异毒株和变异弱毒株YN144的目的。本专利技术为变异弱毒YN144提供了可鉴别的诊断技术,为其作为变异弱毒疫苗使用和推广奠定了基础。附图说明图1:猪流行性腹泻病毒变异毒株S1基因序列的PCR扩增产物图,M:DL2000DNAMarker,1:YN15,2:YN144,3:阴性对照;图2:鉴别变异毒株RT-PCR方法的敏感性试验,M:DL2000DNAMarker,1~8:1×104.7~1×10-2.3TCID50/100μL;图3:含S1基因的重组质粒DNA敏感性试验,M:DL2000DNAMarker,1~9:1.27×109~1.27×101copies/μL;10:阴性对照;图4:特异性试验,M:DL2000DNAMarker,1:PRRSV,2:CSFV,3:TGEV,4:RVA,5:PRV,6:PCV2,7:阳性对照,8:阴性对照本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点,其特征在于:所述酶切位点为ACACGT。

【技术特征摘要】
1.鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的酶切位点,其特征在于:所述酶切位点为ACACGT。2.获得含有权利要求1所述酶切位点的序列片段的引物对,其特征在于:所述引物对为:V-F:5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’,V-R:5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’;其中,合并碱基R为A/G,合并碱基Y为C/T。3.鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法,其特征在于:包括以下步骤:1)获取待测目标样品;2)提取待测目标样品的RNA;3)RNA反转录成cDNA;4)以所获得的cDNA为模板加入引物对进行RT-PCR扩增,扩增得到PCR产物后用琼脂糖凝胶电泳法分析,确定是否为猪流行性腹泻病毒变异毒株;5)当待测目标样品为猪流行性腹泻病毒变异毒株时,使用AflIII酶对PCR产物进行酶切,确定变异毒株是否为猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144。4.根据权利要求3所述鉴定猪流行性腹泻病毒变异弱毒株YN144的方法,其特征在于:所述步骤4)中,引物对为:V-F:5’-TCATCCATTAGTGATGTTGTGTTAGG-3’,V-R:5’-CGACAACRATRTTTTTTCCATCCTG-3’;其中,合并碱基R为A/G,合并碱基Y为C/T。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员:何启盖何东贤陈芳洲吴美洲范盛先张程光李中华孟宪荣
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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