一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法技术

本发明专利技术提供的一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，包括如下步骤：S1、蒙古韭染色体玻片标本的制备；S2、45S rDNA探针的制备，从玉米45S rDNA序列中选取一段保守序列合成探针，并在探针序列的5’端或3’端连接荧光基团，所述探针序列为SEQ ID NO：1‑3中所示的任意一个核苷酸序列；S3、染色体荧光原位杂交；S4、洗脱、检测；上述的荧光原位杂交方法可以对蒙古韭进行荧光原位杂交，能够清楚的显示蒙古韭染色体45S rDNA位点，杂交特异性高，可以较好的应用于蒙古韭的染色体检测，方便于对其染色体核型进行分析。

A fluorescence in situ hybridization method for chromosomes of Allium mongolicum

The present invention provides a fluorescence in situ hybridization method for Leek chromosome, which includes the following steps: preparation of S1 and slide specimens of Leek chromosome; preparation of S2 and 45S rDNA probes, selection of a conservative sequence from maize 45S rDNA sequence to synthesize probes, and connection of fluorescent groups at the 5'or 3' ends of the probe sequence, the probe sequence shown in SEQ ID NO:1_3. A nucleotide sequence; S3, chromosome fluorescence in situ hybridization; S4, elution, detection; the above-mentioned fluorescence in situ hybridization method can carry out fluorescence in situ hybridization of Allium mongolicum, can clearly display 45S rDNA locus of chromosome of Allium mongolicum, with high hybridization specificity, and can be better applied to chromosome detection of Allium mongolicum, which is convenient for chromosome karyotype analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法
本专利技术属于细胞遗传学和分子生物学
，具体涉及一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法。
技术介绍
荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是20世纪80年代末开始发展起来的一种重要的非放射性标记原位杂交技术，在研究植物分子细胞遗传学、基因扩增、基因作图及植物进化和亲缘关系的鉴定上已广泛应用，重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交，容易产生较高的分辨率，因为这些DNA多拷贝序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。核糖体rRNA基因是生物最重要的管家基因之一，其转录产物与核糖体蛋白质一起组装成核糖体。高等植物核主体rDNA(18S、5.8S、28S)和5SrDNA是由高度重复的序列组成，它们是基因编码区，选择压力大，属高度保守区，在植物基因组中有几百乃至上千拷贝，它们以串联重复排列的方式成簇分布在染色体的一个或数个部位，采用18SrDNA和5SrDNA探针对植物染色体进行荧光原位杂交(FISH)可以定位18SrDNA和5SrDNA在染色体上的位置，为植物基因组的进化和核型分析提供重要信息。蒙古韭(学名：AlliummongolicumRegel)是百合科，葱属多年生草本植物，别名为沙葱，在我国范围内，分布于新疆东北部、青海北部、甘肃、宁夏北部、陕西北部、辽宁西部等。蒙古韭富含必需微量元素、维生素和氨基酸等各种营养成分，此外，蒙古韭可入药，能开胃、消食、杀虫，主治消化不良、不思饮食、秃疮、青腿病等多种疾病，具有除瘴气排恶毒等重要的药理作用，被誉为“大漠野菜”、“沙原佳蔬”、“菜中灵芝”。然而，目前对蒙古韭的的核型分析还是采用经典的细胞学手段，还未见将荧光原位杂交方法应用到蒙古韭中以进行核型分析的相关报道。为此，本专利技术提供了一种快速、精确的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，染色染色体分散好、荧光信号强的染色体。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种快速、精确的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，染色染色体分散好、荧光信号强的染色体。本专利技术提供了一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，包括如下步骤：S1、蒙古韭染色体玻片标本的制备；S2、45SrDNA探针的制备，从玉米45SrDNA序列中选取一段保守序列合成探针，并在探针序列的5’端或3’端连接荧光基团，所述探针序列为SEQIDNO：1-3中所示的任意一个核苷酸序列；S3、染色体荧光原位杂交；S4、洗脱、检测。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述探针序列如SEQIDNO：1-2任一所示。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，在S1步骤中，所述蒙古韭染色体玻片标本的制备包括如下步骤：(1)取材：取蒙古韭种子用蒸馏水冲洗1-3次，然后在浸种液中浸泡，然后置于放有2层湿滤纸的培养皿内，加水后置于恒温箱中于22-25℃下培养，待种子根尖长至0.5-1cm，切取根尖1-2mm；(2)制片：将切取的根尖装入小瓶中，适量加水、封盖后，迅速置于0℃冰水混合物中，在0℃的冰箱中预处理20-24h；(3)固定：冲洗上述预处理后的根尖，用现配的卡诺氏固定液(冰醋酸：酒精＝1:3)在室温(25℃)下固定12-24h；(4)解离：取步骤(3)中的根尖用蒸馏水洗2次，每次6min，以洗去固定液，然后用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5％(w/w)，在37℃解离根尖1小时后，用蒸馏水洗去酶液，再用现配的卡诺氏固定液(冰醋酸：酒精＝1:3)在室温(25℃)下固定1-2h；(5)染色：取出根尖用解剖刀切下0.5mm左右置于载玻片上，滴一滴染色液染色，然后放上盖玻片，染色5min后，取滤纸，覆盖在盖玻片上，固定滤纸，然后压片使根端部组织分散摊开；(6)镜检：装片于显微镜，观察细胞内染色体分布情况，并将分散好的玻片标本保存于-20℃下环境中。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由红糖、甘露醇、丙酮和水组成。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由如下浓度的成份组成：红糖，70-90mg/L；甘露醇，120-170mg/L；丙酮，10-40mg/L；余量为水。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由如下浓度的成份组成：红糖，80mg/L；甘露醇，150mg/L；丙酮，25mg/L；余量为水。本专利技术还提供了一种蒙古韭的根尖染色制片方法，包括如下步骤：(1)取材：取蒙古韭种子用蒸馏水冲洗1-3次，然后在浸种液中浸泡，然后置于放有2层湿滤纸的培养皿内，加水后置于恒温箱中于22-25℃下培养，待种子根尖长至0.5-1cm，切取根尖1-2mm；(2)制片：将切取的根尖装入小瓶中，适量加水、封盖后，迅速置于0℃冰水混合物中，在0℃的冰箱中预处理20-24h；(3)固定：冲洗上述预处理后的根尖，用现配的卡诺氏固定液(冰醋酸：酒精＝1:3)在室温(25℃)下固定12-24h；(4)解离：取步骤(3)中的根尖用蒸馏水洗2次，每次6min，以洗去固定液，然后用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5％(w/w)，在37℃解离根尖1小时后，用蒸馏水洗去酶液，再用现配的卡诺氏固定液(冰醋酸：酒精＝1:3)在室温(25℃)下固定1-2h；(5)染色：取出根尖用解剖刀切下0.5mm左右置于载玻片上，滴一滴染色液染色，然后放上盖玻片，染色5min后，取滤纸，覆盖在盖玻片上，固定滤纸，然后压片使根端部组织分散摊开；(6)镜检：装片于显微镜，观察细胞内染色体分布情况，并将分散好的玻片标本保存于-20℃下环境中。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由红糖、甘露醇、丙酮和水组成。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由如下浓度的成份组成：红糖，70-90mg/L；甘露醇，120-170mg/L；丙酮，10-40mg/L；余量为水。所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由如下浓度的成份组成：红糖，80mg/L；甘露醇，150mg/L；丙酮，25mg/L；余量为水。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，包括如下步骤：S1、蒙古韭染色体玻片标本的制备；S2、45SrDNA探针的制备，从玉米45SrDNA序列中选取一段保守序列合成探针，并在探针序列的5’端或3’端连接荧光基团，所述探针序列为SEQIDNO：1-3中所示的任意一个核苷酸序列；S3、染色体荧光原位杂交；S4、洗脱、检测；上述的荧光原位杂交方法可以对蒙古韭进行荧光原位杂交，能够清楚的显示蒙古韭染色体45SrDNA位点，杂交特异性高，可以较好的应用于蒙古韭的染色体检测，方便于对其染色体核型进行分析。2.本专利技术提供的一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述探针序列如SEQIDNO：1-2任一所示，选择上述探针序列对蒙古韭进行荧光原位杂交，杂交特异性强，荧光信号强。3.本专利技术提供的一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由红糖、甘露醇、丙酮和水组成，采用上述的浸种液对蒙古韭进行浸种催芽，可以促使蒙古韭种子快速的生根发芽，相对于传统的仅用水在恒温箱中发芽，培养时间由原本的4-5天可以大大缩短，大大节省了时间。4.本专利技术提供的一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，所述浸种液由如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、蒙古韭染色体玻片标本的制备；S2、45S rDNA探针的制备，从玉米45S rDNA序列中选取一段保守序列合成探针，并在探针序列的5’端或3’端连接荧光基团，所述探针序列为SEQ ID NO：1‑3中所示的任意一个核苷酸序列；S3、染色体荧光原位杂交；S4、洗脱、检测。

【技术特征摘要】
1.一种蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、蒙古韭染色体玻片标本的制备；S2、45SrDNA探针的制备，从玉米45SrDNA序列中选取一段保守序列合成探针，并在探针序列的5’端或3’端连接荧光基团，所述探针序列为SEQIDNO：1-3中所示的任意一个核苷酸序列；S3、染色体荧光原位杂交；S4、洗脱、检测。2.根据权利要求1所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，所述探针序列如SEQIDNO：1-2任一所示。3.根据权利要求1或2所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，在S1步骤中，所述蒙古韭染色体玻片标本的制备包括如下步骤：(1)取材：取蒙古韭种子用蒸馏水冲洗1-3次，然后在浸种液中浸泡，然后置于放有2层湿滤纸的培养皿内，加水后置于恒温箱中于22-25℃下培养，待种子根尖长至0.5-1cm，切取根尖1-2mm；(2)制片：将切取的根尖装入小瓶中，适量加水、封盖后，迅速置于0℃冰水混合物中，在0℃的冰箱中预处理20-24h；(3)固定：冲洗上述预处理后的根尖，用现配的卡诺氏固定液在室温下固定12-24h；(4)解离：取步骤(3)中的根尖用蒸馏水洗2次，每次6min，以洗去固定液，然后用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5％(w/w)，在37℃解离根尖1小时后，用蒸馏水洗去酶液，再用现配的卡诺氏固定液在室温下固定1-2h；(5)染色：取出根尖用解剖刀切下0.5mm左右置于载玻片上，滴一滴染色液，染色，然后放上盖玻片，染色5min后，取滤纸，覆盖在盖玻片上，固定滤纸，然后压片使根端部组织分散摊开；(6)镜检：装片于显微镜，观察细胞内染色体分布情况，并将分散的玻片标本保存于-20℃下环境中。4.根据权利要求3所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，所述浸种液由红糖、甘露醇、丙酮和水组成。5.根据权利要求3或4所述的蒙古韭染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，所述浸种液由如下浓度的成份组成：红糖，70-90mg/L；甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：张边江，陈全战，唐宁，王立科，杨平，钱保俐，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32