枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018234。本发明专利技术以一个性状为主，多个性状为辅的思路筛选出一株益生菌即为枯草芽孢杆菌M406，提高了益生菌的使用价值。该枯草芽孢杆菌M406可产生的抗菌活性物质能抑制动物肠道内包括S.typhimurium、Salmonella enteritidis、S.aureus、E.coli、Listeria monocytogenes在内的多种有害菌。该益生菌可以发酵多种糖类产酸，降低肠液pH值。该枯草芽孢杆菌M406产生纤维素酶，可以有效降解粗饲料中的结构性碳水化合物，将部分NSP转化为可溶性糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸类成分，提高粗饲料营养价值。

Bacillus subtilis M406 and its application in preparation of bacteriocin and cellulase

The invention discloses a Bacillus subtilis M406 and its application in the preparation of bacteriocins and cellulase. Bacillus subtilis M406 strain, its preservation number is CCTCC NO: M 2018234. The invention screens out a probiotic bacterium, Bacillus subtilis M406, which is based on one characteristic and supplemented by several characteristics, thereby improving the usage value of probiotics. The antimicrobial active substance produced by Bacillus subtilis M406 can inhibit a variety of harmful bacteria including S. typhimurium, Salmonella enteritidis, S. aureus, E. coli and Listeria monocytogenes in animal intestines. The probiotics can ferment various sugars to produce acid and reduce the pH value of intestinal juice. The cellulase produced by Bacillus subtilis M406 can effectively degrade the structural carbohydrates in crude feed, and convert part of NSP into soluble sugar, fat, protein and amino acid components, so as to improve the nutritional value of crude feed.

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用
本专利技术涉及微生物
，具体地指一种枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用。
技术介绍
芽孢杆菌，G+菌，0.7-0.8μm×1.0-1.5μm，为直或近直的杆状菌体，多数运动，鞭毛侧生，严格好氧或兼性厌氧。异养，好氧代谢、发酵代谢或二者兼有，部分可还原硝酸盐，多数产过氧化氢酶。在处于逆环境时芽孢杆菌内生芽孢，一个芽孢囊中芽孢不多于一个，芽孢为芽孢杆菌的休眠体状态。芽孢抗逆性强，可以耐受温度、干燥、酸碱、消毒剂以及多种不利因素。芽孢在处于适宜环境下会重新转变为营养细胞，进行生长繁殖。部分芽孢杆菌可以产生多种消化酶、细菌素、抗生素等益生物质，并且安全无毒，这是其作为益生菌的先决条件。芽孢杆菌生长和繁殖耗氧量极大，可以在动物肠道内迅速创立无氧条件，与部分有害需氧微生物竞争性夺氧，抑制它们的生长和繁殖，并能促进厌氧益生菌的生长。芽孢杆菌可以降低有害菌对肠道的粘附能力，可能与争夺粘附位点和促进肠上皮细胞黏蛋白的分泌有关，有研究表明B.subtilis可以降低Salmonellaenteritidis黏附肠黏膜上皮细胞的能力。部分芽孢杆菌可以产生多种抗生素、细菌素和类细菌素，产生的种类和数量因细菌种属的差异也各不相同。这些物质能抑制肠道内包括细菌、真菌、霉菌在内的部分有害微生物。比如B.subtilis可以分泌抗生素以及多肽类和蛋白类抑菌物质，抑制部分有害微生物的生长繁殖。有研究表明B.subtilis能抑制Clostridiumwelchii感染导致的鸡坏死性肠炎；B.natto可产生多种抗生素，可以抑制家禽肠道内Salmonella的定植。B.subtilis产生的抗菌活性物质能抑制动物肠道内包括S.typhimurium、Salmonellaenteritidis、S.aureus、E.coli、Listeriamonocytogenes在内的多种有害菌。此外B.subtilis可以发酵多种糖类产酸，降低肠液pH值。芽孢杆菌产生的多种酶，可以补充动物内源性消化酶不足。单胃动物体内缺少能够降解结构性碳水化合物的微生物，对结构性碳水化合物利用率不高，使用益生芽孢杆菌饲喂动物，其可以在消化道内生长繁殖并分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等消化酶，可以有效降解粗饲料中的结构性碳水化合物，将部分NSP转化为可溶性糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸类成分，提高粗饲料营养价值。经过B.subtilis发酵后的棉粕中粗蛋白、粗脂肪含量均有不同程度的提高，并能显著提高小肽含量，同时灰分、NDF、植酸含量降低。在我国农业部公布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中细菌素还未被批准作为饲料添加剂使用。但从目前的研究来看，其高效性和安全性已经得到了人们的认可，细菌的抑菌特性已被用于医疗领域，而细菌素在养殖领域的使用，近年来一直呼声很高。本试验通过对细菌素特性的研究，判断其能否达到作为微生态制剂的要求，并对其抑菌效价做出评价，为细菌素能否作为未来的饲料添加剂积累实验数据。《饲料添加剂品种目录(2013)》显示，霉菌源纤维素酶目前已作为饲料添加剂被使用。而B.subtilis作为一种易培养的安全的益生菌，其所产纤维素酶并未批准被使用，通过分析纤维素酶的特性，对其是否适合作为微生态制剂进行评估，并未其今后的研究积累数据。现技术存在的问题：益生菌的筛选是微生态制剂的研发中最重要的环节，它决定着微生态制剂的使用效果。目前筛选同种属动物源的益生菌对使用动物来说更加安全可靠，从相同物种具有优良性状的亚种体内进行益生菌的筛选是比较受人们认可的方式。1.在大多数研究中，人们往往只关注益生菌的单一性状，鲜有对多个性状的共同筛选，同时又将多种具有不同性状的益生菌混合使用，制成复合菌种进行使用，这样就增加了使用的复杂性，以及研发的成本。2.相关文献中报道的产细菌素细菌培养基LB,培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl10g/L。枯草芽孢杆菌利用该种培养基产生细菌素量少，抑菌效果不明显。目前少有文献报道细菌素的贮藏能力，这也是无法对细菌素作为药物使用提供有力支持。3.相关文献中报道的产纤维素酶培养基：MgSO4·7H2O0.3g，K2HPO4·3H2O1.5g，NaCl5g，酵母粉0.5g，蛋白胨20g，CMC-Na20g，CaCl2·2H2O0.1g，Tween-800.1％(v/v)，定容至1L。将枯草芽孢杆菌接种其中，静置发酵，常常会使培养基表面形成一层菌膜，会减少培养基内氧气的溶解，悬浮培养过程中，细菌会在底部沉淀，不利于发酵的进行。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌M406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用；枯草芽孢杆菌M406可以作为饲用微生物饲喂动物，达到提高肠道健康和饲料转化率的目的。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株，其保藏编号为CCTCCNO：M2018234。本专利技术所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株经16SrRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株，该菌种已于2018年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCCNO：M2018234；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。本专利技术还提供了一种上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株在制备细菌素和纤维素酶中的应用。利用上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株制备细菌素的方法，包括以下步骤：1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株接于LA固体培养基上培养，得到单菌落；2)种子液制备：将挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养，至菌株对数生长中期，得到种子液；3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中培养发酵，得到发酵液，其中，种子液的接种量为0.5～2％(v/v)；4)细菌素粗提：微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为20～40％，沉淀培养液，离心再用PBS溶解沉淀，得到细菌素粗提液；5)对细菌素粗提液在无菌状态下进行过滤除菌，得到细菌素。进一步地，所述步骤1)中，培养条件：培养温度为30～37℃，时间为12～24h，LA固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L；所述步骤2)中，培养条件：培养温度为30～37℃、时间为5～24h、摇床转速为150～220r/min；LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L。再进一步地，所述步骤3)中，培养条件：培养温度为30～37℃，摇床转速为150～220r/min、时间为12～24h，产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L。利用上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(Bac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M406菌株，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018234。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株，其保藏编号为CCTCCNO：M2018234。2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株在制备细菌素和纤维素酶中的应用。3.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株制备细菌素的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M406菌株接于LA固体培养基上培养，得到单菌落；2)种子液制备：将挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养，至菌株对数生长中期，得到种子液；3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中培养发酵，得到发酵液，其中，种子液的接种量为0.5～2％；4)细菌素粗提：微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为20～40％，沉淀培养液，离心再用PBS溶解沉淀，得到细菌素粗提液；5)对细菌素粗提液在无菌状态下进行过滤除菌，得到细菌素。4.根据权利要求3所述制备细菌素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件：培养温度为30～37℃，时间为12～24h，LA固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L；所述步骤2)中，培养条件：培养温度为30～37℃、时间为5～24h、摇床转速为150～220r/min；LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L。5.根据权利要求3所述制备细菌素的方法，其特征在于：所述步骤3)中，培养条件：培养温度为30～37℃，摇床转速为150～220r/min、时间为12～24h，产细菌素培养基配方：...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏向华，王新锴，胡军，侯奇良，牛耀嵘，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42