一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用，属于黄曲霉毒素脱毒技术领域。本发明专利技术降解黄曲霉毒素的微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明专利技术的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用。

A Microbial Preparation Degrading Aflatoxin and Its Application

The invention discloses a microbial preparation for degrading aflatoxin and its application, belonging to the technical field of aflatoxin detoxification. The effective components of the aflatoxin-degrading microbial preparation of the invention are Siamese Bacillus suspension or Siamese Bacillus whole culture medium culture or crude extract of Siamese Bacillus or extracellular metabolite of Siamese bacillus; the Siamese bacillus is Siamese Bacillus A2025, which is stored in the general microorganism of China Microbial Species Preservation and Management Committee on 12 April 2018. The storage number is CGMCC NO:15611, and the address is No. 3, No. 1 Hospital, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing. The requested storage unit is Shandong Peanut Research Institute. The Bacillus Sinensis A2025 of the invention has high degradation effect on aflatoxin.

【技术实现步骤摘要】
一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用
本专利技术属于黄曲霉毒素脱毒
，具体涉及一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用。
技术介绍
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)等真菌产生的次级代谢物。从分子结构上分析，该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物。曲霉毒素具有极强的致畸、致癌、致突变性，广泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等农产品和食品。我国是花生出口大国，每年都有出口花生到日本和欧盟因为黄曲霉毒素超标而导致的退回事件，是影响我国出口花生的主要问题。现在已鉴定出二十多种黄曲霉素素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广，并且毒性最强，1993年AFB1被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)归为IA类致癌物。目前常用的脱除AFB1方法主要是物理法和化学法。物理法包括有挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法或者耗费大量人力物力效率不高，或者会破坏农产品的营养成分，以加热去除为例，AFB1的热稳定性较高，分解温度为在268℃。化学法是利用一些氧化剂、氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低，但有很大的局限性，很多试剂对操作人员的皮肤、眼睛、呼吸道造成伤害，并且化学试剂残留不易去除，影响农产品和食品的质量安全。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。微生物不同，脱毒效率明显不同，很多微生物能去除的AFB1效率低，需要寻找脱毒效率高的菌株。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂以及使用该微生物制剂对于黄曲霉毒素污染的农产品脱毒的方法。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为：一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的制备方法为：取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mLLB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡发酵培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物的制备方法为：取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，上清液即为暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物。在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025粗提物的制备方法为：暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后，10000r/min离心10min得到的液体经0.22μm滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的粗提物。上述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在被黄曲霉毒素污染的农产品或由该农产品进一步加工成的制品脱毒中的应用。一种黄曲霉毒素的脱毒方法，将上述微生物制剂与含有黄曲霉毒素的样品按照5mL/g混合，于37℃下孵育72h。在上述方案的基础上，所述微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物。在上述方案的基础上，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。本专利技术技术方案的优点本专利技术的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用，并且对黄曲霉毒素的降解率随着孵育时间的增加而提高，其中，在37℃孵育72h时降解效果最好。本专利技术的暹罗芽孢杆菌A2025不仅能够高效降解黄曲霉毒素B1，降解率97.1％；还对黄曲霉毒素G1具有很好的降解作用，降解率95.9％。而且，本专利技术的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素的降解作用是细菌分泌至胞外的活性代谢物质主导的生物降解作用，不是细菌细胞壁的吸附作用。用本专利技术的暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物处理被黄曲霉毒素污染的花生，可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。附图说明图1A2025菌落形态图；图2A2025菌株16SrRNA琼脂糖凝胶电泳图，左边是Marker，右边两个是A2025的16SrRNA电泳图；图3暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解图谱(A是对照组，B是试验组)；图4不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况。图5暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解图谱(A是试验组，B是对照组)；图6暹罗芽孢杆菌A2025不同组分对AFB1的降解分析。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。本专利技术所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。实施例1样品采集、菌株分离及筛选1、样品采集时间和地点2017年5月5日上午从山东省花生研究所试验基地(青岛市莱西市望城镇)采集花生地土壤样品。2、样品的处理、菌株的分离和筛选在超净台中取1g采集的土壤样品悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37℃进行培养，3天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，得到一个菌株，编号A2025。实施例2菌株A2025的鉴定按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株A2025进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：1、形态特征：菌株A2025在LB培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明(图1)，在37℃培养2天后，菌落约为4-6mm，培养3天后菌落表面出现皱褶。2、生理生化特征：氧化酶活性为阴性，能在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉，不能利用吐温40和吐温80。3、16SrRNA基因分析提取A2025的细菌基因组DNA，利用16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。

【技术特征摘要】
1.一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。2.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的制备方法为：取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mLLB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。3.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明清，孙杰，张初署，于丽娜，毕洁，杨庆利，刘宾，赵善仓，江晨，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37