一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用。所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含脂肪酸、阳离子脂质和胆固醇。本发明专利技术的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便等优点。作为核酸类药物阳离子基因转染试剂，本发明专利技术提供的一种以新型脂肪酸为组分的阳离子脂质体与市售商品化基因转染试剂liposome 2000相比具有明显较低的细胞毒性，和显著升高的基因转染效率，可以作为新型类脂质基因载体功能试剂在核酸类药物的转染中得到应用。

A cationic liposome with fatty acid as membrane material and its preparation method and Application

The invention discloses a cationic liposome with fatty acid as membrane material, a preparation method and application thereof. The cationic liposome has a membrane, which comprises fatty acids, cationic lipids and cholesterol. The cationic liposome of the invention has the advantages of high efficiency, safety, stability, good targeting uniformity, stable and reliable quality, and simple preparation process. As a cationic gene transfection reagent for nucleic acid drugs, the cationic liposome with a new fatty acid component provided by the present invention has lower cytotoxicity and higher gene transfection efficiency than the commercial gene transfection reagent liposome 2000, and can be used as a novel lipid-like gene carrier functional reagent in the transfection of nucleic acid drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用。
技术介绍
随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗逐渐成为针对遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病的一种的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。因此，研制安全高效的非病毒基因载体是目前基因治疗中亟待解决的问题。阳离子脂质体(cationicliposomes,CLs)是目前非病毒基因载体领域的研究热点，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、外源基因不易被降解等优点。1987年，阳离子脂质体首先由Felgner等应用于核酸类药物的传递。目前，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。然而，到目前为止，虽然国内外已经报道了多种阳离子脂质体，市面上也有出售的阳离子脂质体如：LipofectamineTM2000TransfectionReagent、LipofectamineTMLTXReagentwithPLUSTMReagent，但是大多数阳离子脂质体在血液循环中不稳定，还具有较高的细胞毒性。因此，如何提高转染效率、降低细胞毒性和提高其稳定性是影响阳离子脂质体作为非病毒载体应用于基因治疗的关键。此外，目前阳离子脂质体所采用的常用原料有阳离子脂质和辅助磷脂。阳离子脂质主要有氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵。由与这些原料本身的物理化学性质，使得所制备的阳离子脂质体存在如成本较高，毒性大，稳定性差，储存周期短等问题。不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种脂肪酸，人体必需的脂肪酸。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸二种。食物脂肪中，单不饱和脂肪酸有油酸，多不饱和脂肪酸有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等。人体不能合成亚油酸和亚麻酸，必须从膳食中补充。根据双键的位置及功能又将多不饱和脂肪酸分为ω-6系列和ω-3系列。亚油酸和花生四烯酸属ω-6系列，亚麻酸、DHA、EPA属ω-3系列。它具有以下的生理功能：1.保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能；2.使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯；3.是合成人体内前列腺素和凝血恶烷的前躯物质；4.降低血液粘稠度，改善血液微循环；5.提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。它还具有调节血脂、清理血栓、免疫调节、维护视网膜提高视力、补脑健脑、改善关节炎症状减轻疼痛的作用。过去研究已经提出了用中短链脂肪酸作为材料制备脂质体，但是还没有任何关于合成的长链脂肪酸作为脂质体膜材料用于制备空白阳离子脂质体携载药物的报道，并且由于纯的中短链脂肪酸没有必需脂肪酸，应用后会有几率出现血栓性静脉炎、面部潮红、恶心、脑电图改变、脑病、乳酸酸中毒等的副作用，所以应用人体必需的长链脂肪酸制备脂质体对于基因递送载体的研究有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的脂质体包封率低、稳定性差、制备工艺复杂以及靶向性有待进一步提高等缺陷，而提供了一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体其制备方法及应用。本专利技术的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向性强、均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便等优点，并可用于包封核酸类药物。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案如下：一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含如式I的脂肪酸：作为优选，所述的膜还包含阳离子脂质；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1，较佳地为0.1:1～20:1，更佳地为0.1:1～10:1。作为优选，所述的膜进一步包含胆固醇；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～50:1，较佳地为0.5:1～20:1，更佳地为0.5:1～10:1。作为优选，所述的阳离子脂质为阳离子类脂，较佳地为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。本专利技术中，所述的阳离子脂质体的是一种50～600纳米的阳离子脂质体，较优地为50～400纳米，更优地为100～300纳米的阳离子脂质体。本专利技术中，所述的阳离子脂质体具有10～50毫伏的表面电位，优选为20～45毫伏的表面电位。本专利技术的另一目的是提供一种上述的阳离子脂质体的制备方法，包括以下步骤：(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的脂肪酸以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。作为优选，所述的如式I所示的脂肪酸的制备方法如下：(1)10-羰基十八碳酸的制备：将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～2)：(1～2)：(2～4)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1/14(ml/mg)，继续搅拌2～3小时，然后萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；其中卤代烃类溶剂较佳地为氯仿和二氯甲烷；(2)10-氨基十八碳酸的制备：将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～2)：(2～8)：(1～2)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌，然后萃取、干燥、减压浓缩分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；其中醇类溶剂较佳地为乙醇和异丙醇的一种或两种；(3)10-氨基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，加入二氯亚砜，加入的二氯亚砜与10-氨基十八碳酸的摩尔比为1:(10～20)，混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；其中醇类溶剂较佳地为乙醇和异丙醇的一种或两种；(4)10-油酸酰胺基十八碳酸的制备：将10-氨基十八碳酸甲酯、油酸、N-(3-Dimethylaminopro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含如式I的脂肪酸：

【技术特征摘要】
1.一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含如式I的脂肪酸：2.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的膜还包含阳离子脂质；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1，较佳地为0.1:1～20:1，更佳地为0.1:1～10:1。3.如权利要求2所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的膜进一步包含胆固醇；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～50:1，较佳地为0.5:1～20:1，更佳地为0.5:1～10:1。4.如权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质为阳离子类脂，较佳地为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。5.一种如权利要求3-4任一项所述的阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的脂肪酸以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸的制备方法如下：(1)10-羰基十八碳酸的制备：将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～2)：(1～2)：(2～4)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1/14(ml/mg)，继续搅拌2～3小时，然后萃取、干燥、减压浓缩、分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；(2)10-氨基十八碳酸的制备：将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～2)：(2～8)：(1～2)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌，然后萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；(3)10-氨基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭丽华，王毛泽，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33