同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，利用iTRAQ试剂和iodoTMT试剂的质量报告基团分子量不同和结合多肽位置不同的特征，应用iodoTMT试剂标记蛋白质半胱氨酸，同时应用iTRAQ试剂标记多肽氨基末端，实现同时检测半胱氨酸氧化还原水平和蛋白质表达丰度的变化，从而可准确判断蛋白质氧化还原水平的变化。本发明专利技术在另一方面还公开了上述方法在同时定量分析细胞、组织及体液等样品中蛋白质丰度与半胱氨酸氧化还原水平中的应用。

【技术实现步骤摘要】
同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其在细胞、组织及体液等样品中的应用。
技术介绍
蛋白质半胱氨酸氧化修饰(Cysteineoxidativemodification，Cys-氧化修饰)是一类由活性氧分子(ROS)介导的作用于Cys的蛋白质翻译后修饰。蛋白质中的Cys残基含有富含电子的硫原子，是ROS介导氧化还原的敏感靶点之一。Cys-氧化修饰包括由ROS引发的二硫键(S-S)形成、S-谷胱甘肽化(-SSG)、S-磺胺化(-SN)、S-亚磺酰化(-SOH)、次磺酰化(-SO2H)，以及S-磺酰化(-SO3H)。其中，Cys氧化形成的S-S、-SSG和-SOH可以被相应的还原剂还原成游离巯基(-SH)。这三种形式的Cys可逆修饰可以通过调节蛋白质构象与功能，从而影响细胞生理过程和细胞稳态。近年来，蛋白质Cys可逆氧化还原修饰作为一个新兴的研究热点，越来越受到科研工作者的关注。因此，发展能对生物体内蛋白质Cys-氧化修饰进行定量检测的方法，可极大推动相关的生理生化研究。近年来，逐渐发展起来的一系列氧化还原蛋白质组学技术为系统研究细胞、组织及体液等样品的蛋白质氧化还原修饰提供了重要手段。其中，差异烷基化技术是研究蛋白质Cys-可逆氧化修饰的常用方法。该技术先利用N-乙基马来酰亚胺(NEM)或碘乙酰胺(IAM)等烷基化试剂封闭游离巯基，再利用还原剂如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)对已被可逆氧化修饰的Cys进行还原，进而应用不同试剂标记还原后新形成的自由巯基，并通过生物质谱鉴定氨基酸序列或Cys位点，从而实现对蛋白质的氧化还原水平进行定量分析。早前，广泛应用的标记试剂主要包括可与巯基特异结合的荧光试剂，如单溴二胺(mBBr)或吲哚乙酰氨基荧光素(IAF)；与生物素结合的巯基特异性试剂，如biotin-HDPD或biotin-IAM/NEM/maleimide。这些试剂标记后的蛋白质往往通过双向电泳(2DE)被分离。2DE凝胶上呈现的蛋白质斑点大小可反映Cys被氧化的蛋白质丰度。但是，基于2DE技术的氧化还原蛋白质组学技术操作步骤繁琐，重复性不稳定，对于特殊蛋白质(如极端等电点、极端分子量和低丰度蛋白质)分离效果不好。尽管基于2DE技术可以检测蛋白质总体Cys氧化还原水平的变化，但无法对蛋白质中被修饰的Cys进行定量分析。后来，人们又发展了多种可与Cys直接发生作用的同位素标签，包括同位素亲和标签(ICAT)、可逆巯基特异性串联质量标签(CysTMT)和不可逆巯基特异性串联质量标签(iodoTMT)。这些同位素标签可直接实现对蛋白质可逆修饰Cys的定量。然而，尽管这些标签可以直接对蛋白质Cys的氧化还原水平进行定量，但是无法同时定量蛋白质丰度，从而导致无法准确判断蛋白质氧化还原水平的变化。因此，发展同时检测蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的定量技术十分必要。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种规模化同时定量分析细胞、组织及体液等样品中蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的蛋白质组学方法。其具体技术方案如下：本专利技术在第一方面提供了一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，包括以下步骤：步骤1、采用烷基化试剂封闭蛋白质上游离的巯基，烷基化试剂优选为N-乙基马来酰亚胺(NEM)；步骤2、采用还原剂对已被可逆氧化修饰的半胱氨酸进行还原，还原剂优选为三(2-羧乙基)膦(TCEP)；步骤3、对还原后的蛋白质进行脱盐处理；步骤4、采用iodoTMT标签标记经脱盐处理后的蛋白质；步骤5、电泳分离步骤4中得到的蛋白质，并进行消化处理；电泳优选采用SDS-PAGE电泳，消化处理优选采用胰蛋白酶和胶内酶切的方法；步骤6、采用脱盐柱对步骤5中消化得到的多肽样品进行脱盐处理；步骤7、采用iTRAQ标签标记多肽样品，优选采用ABSCIEX公司生产的iTRAQ试剂；步骤8、采用脱盐柱对iTRAQ标签标记后的多肽样品进行脱盐处理；步骤9：采用超高效液相色谱分离步骤8中脱盐处理后的多肽样品，优选地采用Waters公司的AcquityUPLC超高效液相色谱对肽段样品进行分级；步骤10、采用高分辨质谱仪鉴定各分级多肽样品；优选地采用WatersnanoAcquityUPLC和ThermalOrbitrapFusion高分辨质谱仪对多肽样品进行鉴定，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的100％乙腈溶液，以200nL/min的流速洗脱180min；步骤11、搜索相应的蛋白质数据库，并对搜库结果进行分析。优选地，上述步骤3中，采用Zeba脱盐离心柱进行脱盐处理。优选地，上述步骤4中，采用iodoTMT标签标记蛋白质后，用二硫苏糖醇终止反应。在一个较优实施例中，步骤6中的脱盐柱为C18脱盐柱，其制备方法为：用直径为1.5mm的平口针头戳取两片3MEmporeC18SPE膜片，再用直径为0.7mm的平口针头套于1.5mm的平口针头内部，将双层C18膜片填于低吸附的200μl移液器吸头中。进一步地，上述C18脱盐柱的制备方法还包括：在1.5ml离心管管盖中央剪出直径为0.6cm的圆形区域，然后将移液器吸头插入圆形区域并悬于1.5ml离心管中。优选地，上述C18脱盐柱的使用方法包括以下步骤：步骤1、活化C18脱盐柱：向C18脱盐柱中加入200μl甲醇，2000g离心1min；步骤2、平衡C18脱盐柱：加入200μl含0.2％三氟乙酸和70％乙腈的水溶液，2000g离心1min，并重复一次；再加入200μl0.2％三氟乙酸溶液，2000g离心1min，并重复一次；步骤3、多肽样品结合C18脱盐柱：应用200μl0.2％三氟乙酸复溶多肽样品，将复溶后的多肽样品加至C18脱盐柱，1000g离心3min；将已过柱的溶液再次加至C18脱盐柱上，进行第二次过柱，1000g离心3min；步骤4、脱盐：加入200μl0.2％三氟乙酸溶液冲洗C18脱盐柱两遍；步骤5、洗脱样品：加入100μl含0.1％甲酸和90％乙腈的溶液，静置1min，1000g离心2min，重复三遍后，真空冷冻干燥。在一个较优实施例中，步骤9中的流动相A为含2％乙腈和2mM氨水的溶液，流动相B为含98％乙腈和20mM氨水的溶液，流速为0.25ml/min，洗脱梯度为：初始，0％流动相B；0.1min，1％流动相B；40min，40％流动相B；44min，90％流动相B；48min，90％流动相B；48.1min，2％流动相B；53min，2％流动相B。在一个较优实施例中，步骤10中的HCD碰撞能量设置为40％。优选地，上述步骤11中，应用ProteomeDiscovererTM2.2搜索相应蛋白质数据库；蛋白质修饰的相关参数设置如下：鉴定和定量蛋白质丰度时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰设置为固定修饰，将甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰；鉴定和定量氧化还原修饰蛋白质时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰、甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰。其它参本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、采用烷基化试剂封闭蛋白质上游离的巯基；步骤2、采用还原剂对已被可逆氧化修饰的半胱氨酸进行还原；步骤3、对还原后的蛋白质进行脱盐处理；步骤4、采用iodoTMT标签标记经脱盐处理后的所述蛋白质；步骤5、电泳分离步骤4中得到的所述蛋白质，并进行消化处理；步骤6、采用脱盐柱对步骤5中消化得到的多肽样品进行脱盐处理；步骤7、采用iTRAQ标签标记所述多肽样品；步骤8、采用所述脱盐柱对所述iTRAQ标签标记后的多肽样品进行脱盐处理；步骤9：采用超高效液相色谱分离步骤8中脱盐处理后的所述多肽样品；步骤10、采用高分辨质谱仪鉴定各分级多肽样品；步骤11、搜索相应的蛋白质数据库，并对搜库结果进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、采用烷基化试剂封闭蛋白质上游离的巯基；步骤2、采用还原剂对已被可逆氧化修饰的半胱氨酸进行还原；步骤3、对还原后的蛋白质进行脱盐处理；步骤4、采用iodoTMT标签标记经脱盐处理后的所述蛋白质；步骤5、电泳分离步骤4中得到的所述蛋白质，并进行消化处理；步骤6、采用脱盐柱对步骤5中消化得到的多肽样品进行脱盐处理；步骤7、采用iTRAQ标签标记所述多肽样品；步骤8、采用所述脱盐柱对所述iTRAQ标签标记后的多肽样品进行脱盐处理；步骤9：采用超高效液相色谱分离步骤8中脱盐处理后的所述多肽样品；步骤10、采用高分辨质谱仪鉴定各分级多肽样品；步骤11、搜索相应的蛋白质数据库，并对搜库结果进行分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，采用Zeba脱盐离心柱进行脱盐处理。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，采用iodoTMT标签标记所述蛋白质后，用二硫苏糖醇终止反应。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，所述脱盐柱为C18脱盐柱，其制备方法为：用直径为1.5mm的平口针头戳取两片3MEmporeC18SPE膜片，再用直径为0.7mm的平口针头套于1.5mm的平口针头内部，将双层C18膜片填于低吸附的200μl移液器吸头中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C18脱盐柱的制备方法还包括：在1.5ml离心管管盖中央剪出直径为0.6cm的圆形区域，然后将所述移液器吸头插入所述圆形区域并悬于1.5ml离心管中。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C18脱盐柱的使用方法包括以下步骤：步骤1、活化C18脱盐柱：向所述C18脱盐柱中加入200μl甲醇，2000g离心1min；步骤2、平衡C18脱盐柱：加入200μl含0.2％三氟乙酸和...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴绍军，喻娟娟，李莹，陈思学，秦智，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31