用于基因编辑的组合物和方法技术

本发明专利技术题为“用于基因编辑的组合物和方法”。本申请提供了使用Argonaute(Ago)和单链引导DNA修饰靶核酸的方法、组合物、递送系统和试剂盒。在一些实施方案中，提供了在细胞诸如哺乳动物细胞中进行基因编辑的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因编辑的组合物和方法相关专利申请的交叉引用本申请要求于2015年12月21日提交的中国专利申请No.201510971234.5和2016年5月25日提交的中国专利申请No.201610349444.5的优先权权益，每篇专利申请内容全文以引用方式并入本文中。提交序列表的ASCII文本文件将以下以ASCII文本文件提交的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：777072000140SEQLIST.txt，记录日期：2016年12月15日，大小：309KB)。
本专利技术涉及可用于靶核酸的序列特异性修饰(包括细胞中基因编辑)的基于Argonaute的方法、组合物和递送系统。
技术介绍
对基因信息的深入了解和基因疗法的开发需要准确而有效的基因编辑工具。作为基因工程中迅速发展的
，基因或基因组编辑采用核酸酶将序列特异性修饰(诸如突变、插入和置换等)引入基因或基因组中。当前的基因编辑技术通常涉及三个步骤。首先，使一种或多种专门设计的引导DNA或RNA(引导元件)和内切核酸酶(基因切割元件)彼此结合，其中前种元件将后种元件引导至靶基因的特定基因座。第二，内切核酸酶切割靶基因的特定基因座，在靶基因两条链中的每条中诱导切口或间隙，从而产生双链断裂(DSB)。最后，DSB激活细胞中的内源DNA修复机制，该机制修复断裂并同时在修复位点引入修饰，诸如突变、插入和置换。大多数真核细胞依赖于两种DSB修复机制：非同源末端连接(NHEJ)和同源介导的修复(HDR)。NHEJ利用一系列酶来直接连接DNA的两个断裂末端。因此，NHEJ是一种易错配、低保真性的修复途径，通常在修复期间引入突变。相比之下，HDR需要同源序列充当模板以在DSB处恢复丢失的DNA序列。HDR中对同源模板的需要可用于将外源序列引入基因组的靶基因座中。HDR的机制类似于同源重组。然而，因为HDR是基于DSB的修复途径，使用HDR引入外源序列的效率比使用同源重组约高三个数量级。因此，通过修复和修饰诱导的DSB，NEJH和HDR能够使用核酸酶进行高效的基因编辑。基因编辑技术对于我们对基因功能、基因工程、以及基因疗法开发的理解具有革命性的影响。目前，四种主要的核酸酶家族广泛用于基因编辑：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、工程大范围核酸酶/再工程化归巢内切酶、以及CRISPR/Cas9系统。前三个核酸酶家族的应用受到各种局限性的挑战，其包括需要特定靶序列、用于适应不同靶序列的专用设计的核酸酶，并且脱靶效应较高。CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑系统。细菌来源的酶即Cas9可利用引导RNA在基因组中PAM序列的近侧和上游的任何靶基因座处理论地切割并诱导DSB。然而，因为RNA易于形成二次结构，Cas9系统在编辑富GC基因中具有较低效率。另外，由于细胞天然地产生大量RNA片段，仍然存在Cas9结合非特异性RNA的可能性，并从而切割基因组中的非靶基因座。还已知Cas9对引导RNA和靶DNA之间的错配具有相对高的耐受性。例如，引导RNA与靶DNA之间多至5个核苷酸错配并不妨碍Cas9切割。因此，Cas9系统受其脱靶效应的限制。Argonaute是普遍存在于细菌、植物、古生菌和动物细胞中的核酸结合蛋白的家族。Argonaute在RNA干扰(RNAi)中的作用最为人们所熟知。来自大多数菌种的Argonaute蛋白结合非编码寡核苷酸RNA，该非编码寡核苷酸RNA充当Argonaute蛋白的引导RNA，从而经由序列互补性识别靶mRNA，并随后诱导mRNA降解或转录抑制，由此抑制基因翻译。近年来，来自细菌菌种嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的Argonaute(“TtAgo”)示出结合单链DNA(ssDNA)并将ssDNA用作降解DNA质粒的引导物。该现象表明，来自一些菌种的Argonaute是DNA引导的DNA核酸内切酶。然而，TtAgo需要高温(＞65℃)来实现其内切核酸酶活性，因此不适合作为基因编辑工具。本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
技术实现思路
本专利申请提供了使用Argonaute(Ago)蛋白和短单链引导DNA修饰靶核酸的方法、组合物、递送系统和试剂盒。靶核酸可存在于体外或细胞内。靶核酸的示例性修饰包括但不限于位点特异性切割、引入突变、插入外源序列、序列置换和基因表达改变。本申请的一个方面提供了一种修饰靶核酸的方法，包括在约10℃至约60℃的温度(诸如约37℃)下使靶核酸与Argonaute(Ago)蛋白和单链引导DNA接触，其中Ago蛋白和引导DNA形成特异性识别靶核酸中的靶基因座的复合物，并且其中靶基因座包含与引导DNA的序列互补的序列。在一些实施方案中，复合物切割靶基因座。在一些实施方案中，其中靶基因座是双链DNA，Ago蛋白诱导靶基因座的双链断裂。在根据上述任一种方法的一些实施方案中，Ago蛋白和引导DNA存在于预形成的复合物中。在一些实施方案中，在低于约50℃的温度下引导DNA不与Ago蛋白解离。在根据上述任一种方法的一些实施方案中，靶基因座的序列包含对引导DNA的序列的不超过约3个(诸如3个、2个、1或0个的任一种)错配。在根据上述任一种方法的一些实施方案中，靶基因座具有至少约60％(诸如至少约60％、65％、70％、75％、80％的任一种或更大)的GC含量。在根据上述任一种方法的一些实施方案中，Ago蛋白在5′-磷酸盐结合位点的KQK基序中包含3个保守氨基酸中的至少2个。在一些实施方案中，Ago蛋白在核酸酶活性位点的DDE基序中包含3个保守氨基酸中的至少2个。在根据上述任一种方法的一些实施方案中，Ago蛋白来源于选自以下的生物体：格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、Halogeometricumpallidum、亚洲嗜盐碱杆菌(Natrialbaasiatica)、西藏嗜盐碱红菌(Natronorubrumtibetense)、隐红碱线菌(Natrinemapellirubrum)、伯林盐几何菌(Halogeometricumborinquense)、Thermococcusbarophilus、嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)、嗜冷嗜盐菌(Halorubrumlacusprofundi)、微囊藻属(Microcystissp.)、聚球藻属(Synechococcussp.)、梭菌属(Clostridiumbartlettii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)、梭菌属(Clostridiumsp.)、Intestinibacterbartlettii、嗜热古菌(Ferroglobusplacidus)、盐杆菌属(Halobacteriumsp.)、Methanocaldococcusfervens、浅黄假单胞菌(Pseudomonasluteola)、Thermogladiu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰靶核酸的方法，包括在约10℃至约60℃的温度下使所述靶核酸与Argonaute(Ago)蛋白和单链引导DNA接触，其中所述Ago蛋白和所述引导DNA形成特异性识别所述靶核酸中的靶基因座的复合物，并且其中所述靶基因座包含与所述引导DNA的序列互补的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.21 CN 2015109712345;2016.05.23 CN 201610341.一种修饰靶核酸的方法，包括在约10℃至约60℃的温度下使所述靶核酸与Argonaute(Ago)蛋白和单链引导DNA接触，其中所述Ago蛋白和所述引导DNA形成特异性识别所述靶核酸中的靶基因座的复合物，并且其中所述靶基因座包含与所述引导DNA的序列互补的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Ago蛋白切割所述靶基因座。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶基因座是双链DNA，并且其中所述Ago蛋白诱导所述靶基因座的双链断裂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述温度为约37℃。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Ago蛋白和所述引导DNA存在于预形成的复合物中。6.根据权利要求5所述的方法，其中在低于约50℃的温度下所述引导DNA不与所述Ago蛋白解离。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述靶基因座的序列包含对所述引导DNA的序列的不超过约3个错配。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述靶基因座具有至少约60％的GC含量。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述Ago蛋白来源于选自以下的生物体：格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、Halogeometricumpallidum、亚洲嗜盐碱杆菌(Natrialbaasiatica)、西藏嗜盐碱红菌(Natronorubrumtibetense)、隐红碱线菌(Natrinemapellirubrum)、伯林盐几何菌(Halogeometricumborinquense)、Thermococcusbarophilus、嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)、嗜冷嗜盐菌(Halorubrumlacusprofundi)、微囊藻属(Microcystissp.)、聚球藻属(Synechococcussp.)、梭菌属(Clostridiumbartlettii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)、梭菌属(Clostridiumsp.)、Intestinibacterbartlettii、嗜热古菌(Ferroglobusplacidus)、盐杆菌属(Halobacteriumsp.)、Methanocaldococcusfervens、浅黄假单胞菌(Pseudomonasluteola)、Thermogladiuscellulolyticus、固氮弧菌属物种(Aromatoleumaromaticum)、深海超嗜热古菌(Thermococcusonnurineus)、坎式甲烷火菌(Methanopyruskandleri)、细长聚球藻(Synechococcuselongatus)、好热黄无氧芽孢菌(Anoxybacillusflavithermus)、微小杆菌属(Exiguobacteriumsp.)、鞘丝藻属(Lyngbyasp.)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、Halorubrumkocurii、Burkholderiaambifaria、草根围伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagraminis)、死海盐盒菌(Haloarculamarismortui)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、红细菌目细菌(Rhodobacteralesbacterium)和解肝磷酯土地杆菌(Pedobacterheparinus)。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Ago蛋白来源于格氏嗜盐碱杆菌。11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述Ago蛋白包含与选自SEQIDNO：1-42的序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Ago蛋白包含与SEQIDNO：1具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述引导DNA在5′端被磷酸化。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈啸，韩春雨，
申请(专利权)人：浙江大学，河北科技大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33