一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法，包括如下步骤：取人颅骨间充质干细胞，以10

A method for inducing differentiation of nerve cells from human skull mesenchymal stem cells

The invention relates to a method for inducing differentiation of nerve cells by human skull mesenchymal stem cells, which comprises the following steps: taking human skull mesenchymal stem cells to 10.

【技术实现步骤摘要】
一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法
本专利技术涉及细胞诱导
，具体涉及人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法。
技术介绍
帕金森氏症、阿尔兹海默症及肌萎缩侧索硬化症等神经退化疾病已成为临床常见和难治性疾病。细胞移植治疗为上述疾病治疗提供了新方向，但神经细胞难于获取和扩增，寻找可替代的细胞来源已成为细胞治疗技术用于神经退行性疾病治疗的关键所在。取自脐带和髂骨等组织的间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是中胚层来源的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。研究表明MSCs除了能够向成骨、脂肪和软骨等中胚层方向分化，在一定的条件下还能跨越分化为肝细胞、心肌细胞、胰岛细胞等其他胚层类型细胞，即表现出高度的可塑性。因此，研究建立属于外胚层的颅骨MSCs分化神经细胞的诱导体系，不仅具有理论基础，而且将为日后脑血管疾病的后遗症、脊髓损伤以及神经修复治疗等提供直接、有效的细胞来源，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足，提供一种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法。一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法，包括如下步骤：取人颅骨间充质干细胞，以104～106个/cm2的密度接种至诱导液中，在37℃，5％CO2培养箱中诱导培养21天，获得成熟的神经细胞；诱导液组成：1×N2、1×B27、30～50ng/mlb-FGF、10～30μg/mlVB12，溶剂为DMEM/F12基础培养液。作为优选：所述诱导液终浓度组成：1×N2、1×B27、50ng/mlb-FGF、10μg/mlVB12，溶剂为DMEM/F12基础培养液。作为优选：接种至诱导液中的细胞密度为105个/cm2。本专利技术的有益效果是:本专利技术所述方法能够有效诱导人颅骨间充质干细胞分化为神经细胞，分化所得细胞不仅表达神经细胞标志蛋白，更为重要的是分化成熟细胞具备一定神经细胞超微结构。附图说明图1是诱导液诱导第21天的细胞形态显微图；A图为未开始诱导的颅骨MSCs，B图为诱导液诱导第21天的细胞。A图放大40倍，B图放大100倍。图2是诱导液诱导后细胞表达神经细胞标志蛋白的免疫荧光检测图；A为Tuj-1表达；B为NeuN和NSE表达；C为Syn表达。均放大100倍。图3是诱导液诱导后细胞神经细胞超微结构(突触囊泡)检测图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本专利技术。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本专利技术权利要求的保护范围内。实施例1：人颅骨间充质干细胞的分离将10cm3颅骨骨片用医用电动钻锯切碎后，转移至50mL离心管中，加入25mL生理盐水，混匀后，置于低温摇床中，于8℃，转速为150转/分钟条件下，摇15分钟，200目筛网过滤，滤液1000rpm离心6min，去除上清后，沉淀用细胞培养液悬浮，取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数后，以2×105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37度，含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，至P3代，得到形态单一的纤维样人颅骨间充质干细胞(MSCs)。实施例2：人颅骨间充质干细胞体外分化神经细胞的诱导取实施例1方法获得的P3代人颅骨MSCs，接种至诱导液，37℃，5％CO2培养箱中诱导培养21天，其中每2天换液，收集诱导细胞进行鉴定，获得成熟的神经细胞。诱导液Ⅰ终浓度组成：1×N2、1×B27、50ng/mlb-FGF、10μg/mlVB12，溶剂为DMEM/F12基础培养液(购自Corning公司)。N2、B27购自Gibco公司，b-FGF购自Peprotech公司，VB12购自Sigma公司。实施例3：分化细胞的鉴定(1)形态学观察：未经过诱导的MSCs和诱导液诱导第21天的细胞利用显微镜观察细胞形态，并拍照记录，结果见图1所示，图A放大40倍，图B放大100倍。(2)神经细胞标志蛋白免疫荧光检测：诱导液诱导后的细胞经4％多聚甲醛室温(25℃)固定15min后，用PBS(pH值为7.4)漂洗除去多聚甲醛，再用0.05％TritonX-100(购自Sigma公司)室温浸泡处理10分钟，然后用5％山羊血清(购自生工生物)在室温封闭1h，PBS清洗两次，细胞分成4组，分别加入一抗，组1为抗Tuj-1，组2为抗NeuN和抗NSE，组3为抗Syn，一抗均购自Abcam公司，4℃湿盒孵育过夜；PBS浸洗三次，每次10min；依次加入荧光标记二抗，组1为Alexa488、组2为Alexa488和Alexa647标记二抗，组3为Alexa647(二抗均购自联科生物公司)，37℃孵育1h，PBS浸洗三次；3组细胞DAPI(购自Sigma公司)染核，激光共聚焦显微镜(CarlZeiss)观察拍照。结果见图2(均放大100倍)。(3)神经细胞微结构检测：收集诱导21天的细胞于离心管中，1000rpm/min离心10min，弃上清，细胞沉淀用2.5％戊二醛固定，4℃固定30min，PBS漂洗3次，1％锇酸固定2h，PBS漂洗，丙酮脱水，包埋，90nm切片，透射电镜观察拍照。结果见图3所示。结果表明，诱导所得分化细胞具有神经细胞样形态，表达神经细胞标志蛋白，更为重要的是分化成熟细胞具有一定的神经细胞超微结构(突触囊泡)特征，表明本诱导方法能够有效诱导颅骨间充质干细胞分化神经细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：取人颅骨间充质干细胞，以104～106个/cm2的密度接种至诱导液中，在37℃，5％CO2培养箱中诱导培养21天，获得成熟的神经细胞；诱导液组成：1×N2、1×B27、30～50ng/ml b‑FGF、10～30μg/ml VB12，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

【技术特征摘要】
1.一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：取人颅骨间充质干细胞，以104～106个/cm2的密度接种至诱导液中，在37℃，5％CO2培养箱中诱导培养21天，获得成熟的神经细胞；诱导液组成：1×N2、1×B27、30～50ng/mlb-FGF、10～30μg/mlVB12，溶剂为DMEM/F12基础培...

【专利技术属性】
技术研发人员：麻育源，卢刚，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33