金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化制造技术

技术编号:20007162 阅读:23 留言:0更新日期:2019-01-05 18:43
发明专利技术提供一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型或8型细胞中释放荚膜多糖的方法,包括酸处理细胞的步骤。发明专利技术还提供包含该方法的从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的工艺。其他的加工步骤可能也包括在该工艺中,例如酶处理,如除去核酸,蛋白和/或肽聚糖污染物;渗滤,如除去小分子量污染物;阴离子交换色谱,如除去残余蛋白;和浓缩。

Purification of Capsular Polysaccharides of Staphylococcus aureus Type 5 and 8

The invention provides a method for releasing capsular polysaccharides from S. aureus type 5 or 8 cells, including steps for acid treatment of cells. The invention also provides a process for purifying capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus type 5 or 8 cells including the method. Other processing steps may also be included in the process, such as enzymatic treatment, such as removal of nucleic acids, proteins and/or peptidoglycan contaminants; filtration, such as removal of small molecular weight contaminants; anion exchange chromatography, such as removal of residual proteins; and concentration.

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化本申请要求2009年10月30日提交的美国临时专利申请序列号61/256,905的优先权,其通过引用全文纳入本文。
本专利技术属于纯化细菌荚膜多糖领域,特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的5型和8型荚膜多糖,并且具体用于制备疫苗。技术背景在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而,由于糖是不依赖于T细胞的抗原,它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T-非依赖性抗原转化成T-依赖性抗原,从而增强记忆应答,并产生保护性免疫。因此,最有效的糖疫苗基于糖偶联物,原型偶联疫苗针对流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)(‘Hib’)[例如见参考文献96的第14章]。已经记载另一偶联疫苗的细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。已经从金黄色葡萄球菌中分离到多种多糖用于糖偶联物。两种特别感兴趣的多糖是5型和8型荚膜多糖。大约60%的人金黄色葡萄球菌菌株是8型,大约30%是5型。有关5型和8型偶联物的大量工作是由Fattom等进行的,可参见文献如参考文献1-9。基于多糖的疫苗的出发点是多糖本身,通常纯化自目标细菌。Fattom等开发了一个纯化5型和8型荚膜多糖的复杂工艺,该方法在参考文献1中有详细描述,并且包括下列细菌培养后的关键步骤:在缓冲液中悬浮细菌细胞,溶葡球菌酶处理,DNase和RNase处理,离心,缓冲液透析,蛋白酶处理,进一步透析,过滤,加入乙醇到25%和氯化钙来沉淀污染物;进一步加入乙醇到75%来沉淀多糖;收集和干燥沉淀物;阴离子交换色谱;透析;冻干;大小排阻层析;透析和最后冻干。Fattom工艺涉及到使用溶葡球菌酶来裂解细菌细胞壁并从而释放荚膜多糖。然而,该步骤耗费时间并使得该工艺难以扩大到工业生产。它也增加了整体成本和工艺的复杂性。其他研究者试图省略这个步骤并开发一个更简单且更高效的多糖纯化方法。例如,参考文献[10]描述另一工艺,包括高压灭菌金黄色葡萄球菌细胞,超滤含多糖的上清液,浓缩,冻干,用偏过碘酸钠处理,进一步超滤,渗滤,高效大小排阻液相色谱,透析和冻干。作者指出该方提供了高产率并且适合多糖的大规模生产。该方法中溶葡球菌酶处理被高压灭菌取代以释放荚膜多糖。该方法在文献[10]中进一步发展。在这些替代方法中的一个重要步骤是偏过碘酸钠处理。该步骤用于去除荚膜多糖中的磷壁酸污染物。然而,该步骤又一次增加了该工艺的持续性,复杂性和整体成本。参考文献[12]描述了一个相似的工艺,该方法也涉及到高压灭菌释放荚膜多糖和偏过碘酸钠处理除去磷壁酸。相反,大部分其他小组使用保留溶葡球菌酶处理的工艺(例如,见参考文献13,14,15,16,17和18),有时包括偏过碘酸钠处理(例如,参考文献13和14)。上述方法复杂,并且可能在所得多糖中遗留污染物。因此,需要进一步改善工艺来纯化金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖,并且特别是产生较少污染物的较简单的工艺。
技术实现思路
本专利技术是基于最初通过酸处理从细菌细胞中释放多糖的纯化工艺。该步骤无需溶葡球菌酶处理,并且能用于替代上述工艺中的高压灭菌。专利技术人发现该工艺产生磷壁酸污染较低的纯化多糖。这意味着偏过碘酸钠处理多糖不是必须的。纯化多糖也有低肽聚糖污染,使其特别适合医学应用。因为前面工艺的费力步骤不是必须的,所以专利技术者的工艺迅速而简单。本专利技术提供了一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型或8型细胞中释放荚膜多糖的方法,包括酸处理细胞的步骤。专利技术还提供了包含这种工艺的从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的过程。其他加工步骤也可包括在此工艺中,例如酶处理,如移除核酸、蛋白和/或肽聚糖污染物;渗滤,如移除小分子量污染物;阴离子交换色谱,如移除剩余蛋白;和浓缩。因此,本专利技术提供了一种包含酸处理金黄色葡萄球菌5型或8型细胞以释放多糖的纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺。相似的,本专利技术提供在纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺中,由使用酸处理金黄色葡萄球菌5型或者8型细胞释放多糖组成的改良。酸处理释放无需溶葡球菌酶处理或者高压灭菌释放多糖。本专利技术也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,该工艺不包括溶葡球菌酶处理的步骤。相似的,本专利技术提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,该工艺不包括偏过碘酸钠处理的步骤。通常,该工艺不包括上述步骤中的一个或者两个。本专利技术也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,该工艺提供了包含多糖和肽聚糖污染水平相对于多糖总重小于5%重量(例如≤4%,≤3%,≤2%,≤1%等)的组合物。通常,该组合物包括小于4%重量的肽聚糖,特别是小于3%。专利技术者发现使用专利技术方法得到大约2%或者甚至大约1%的水平。专利技术者发现具有此肽聚糖水平的组合物可用于疫苗生产。相反,参考文献17教授了高于5%的水平即可用于该目的。肽聚糖污染水平可以用本文所述方法测量。相似的,本专利技术提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,该工艺提供了包含多糖和蛋白质污染重量水平相对于多糖总重小于5%(例如≤4%,≤3%,≤2%,≤1%等)的组合物。通常,该组合物包括小于3%重量的蛋白质,特别是小于约2.4%蛋白质污染水平可以用MicroBCA分析(皮尔斯公司(Pierce))来测量。该专利技术也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,该工艺提供了包含多糖和核酸污染水平相对于多糖总重小于1%重量(例如≤0.75%,≤0.50%,≤0.25%,≤0.10%,≤0.01%等)的组合物。通常,该组合物包括小于0.25%重量的核酸,特别是小于约0.09%核酸污染水平可以用分光光度计的260纳米吸收值来测量。本专利技术也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺,其中,(a)肽聚糖污染水平小于5%(如上所述);(b)蛋白质污染水平小于5%(如上所述);(c)核酸污染水平小于1%(如上所述)。本专利技术也提供了含可由专利技术任何工艺获得的金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物。具体地,本专利技术提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物,其中,该组合物包括肽聚糖重量相对于多糖总重小于5%(例如≤4%,≤3%,≤2%,≤1%等)的肽聚糖污染水平。通常,该组合物包括小于3%重量的肽聚糖,特别是小于2%。本专利技术可特定提供大约2%或者甚至大约1%水平的组合物。相似的,本专利技术提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物,其中,该组合物包括蛋白质重量相对于多糖总重小于5%(例如≤4%,≤3%,≤2%,≤1%,≤05%,等)的蛋白质污染水平。通常,该组合物包括小于3%重量的蛋白质,特别是小于约2.4%。本专利技术也提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物,其中,该组合物包括核酸重量相对于多糖总重小于1%(例如≤0.75%,≤0.50%,≤0.25%,≤0.10%,≤0.01%,等)的核酸污染水平。通常,该组合物包括小于0.25%重量的核酸,特别是小于约0.09%。本专利技术也提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物,其中,(a)肽聚糖污染水平小于5%(如上所述);(b)蛋白质污染水平小于5%本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型和8型细胞中释放荚膜多糖的方法,所述方法包括酸处理细胞步骤。

【技术特征摘要】
2009.10.30 US 61/256,9051.一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型和8型细胞中释放荚膜多糖的方法,所述方法包括酸处理细胞步骤。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞采用湿细胞体的形式或者悬浮在液体培养基中;和/或所述酸处理用乙酸进行;和/或所述酸处理产生O-乙酰化程度为60-100%的荚膜多糖;和/或所述方法还包括中和步骤;和/或所述方法还包括细胞离心和收集含多糖上清液的步骤。3.一种从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的工艺,所述工艺包括权利要求1或2所述的方法;其中所述工艺任选还包括用DNase和/或RNase处理荚膜多糖的步骤,和/或用变溶菌素处理荚膜多糖的步骤,和/或渗滤步骤(任选切向流过滤),和/或阴离子交换色谱步骤,和/或凝胶过滤步骤,和/或多糖浓缩步骤,和/或解聚纯化的多糖形成寡糖的步骤,和/或无菌过滤步骤。4.如权利要求3所述的工艺,其特征在于,所述纯化的多糖分子量是2-3500kDa。5.如权利要求3或4所述的工艺,其特征在于,所述工艺提供包含多糖和肽聚糖污染水平相对于多糖总重小于5%重量的组合物,任选所述肽聚糖污染水平约2%重量。6.如权利要求3-5中任一项所述的工艺,其特征在于,所述工艺提供包含多糖和蛋白质污染水平相对于多糖总重小于5%重量的组合物。7.如权利要求3-6中任一项所述的工艺,其特征在于,所述工艺提供包含多糖和核酸污染水平相对于多糖总重小于1%重量的组合物。8.如权利要求3-7中任一项所述的工艺,其特...

【专利技术属性】
技术研发人员:P·科斯塔蒂诺M·R·罗马诺F·伯尔蒂
申请(专利权)人:诺华股份有限公司
类型:发明
国别省市:瑞士,CH

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1