一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，包括以下步骤：一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定；二、四逆汤体内移行成分的确定和峰面积的测定；三、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的峰面积与四逆汤体内移行成分的峰面积的相关性分析，筛选出四逆汤抗心肌缺血药效物质基础。本发明专利技术基于异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血模型，采用超高效液相色谱‑四极杆‑飞行时间质谱的非靶向代谢组学技术和基于超高效液相色谱‑三重四极杆质谱靶向代谢组学技术，筛选出12种四逆汤抗心肌缺血药效物质基础，提高了四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的准确性，缩短了筛选周期，减少了筛选耗费成本。

A Method for Screening the Material Basis of Sini Decoction in Anti-myocardial Ischemia

The invention discloses a method for screening the material basis of Sini Decoction's anti-myocardial ischemia efficacy, which includes the following steps: 1. determination of endogenous metabolites and peak area of Sini Decoction's anti-myocardial ischemia; 2. determination of transitional components and peak area of Sini Decoction; 3. peak area of endogenous metabolites of Sini Decoction's anti-myocardial ischemia and transitional components of Sini Decoction. Based on the correlation analysis of peak area, the pharmacodynamic basis of Sini Decoction against myocardial ischemia was screened out. Based on the rat model of myocardial ischemia induced by isoproterenol, the present invention adopts non-targeted metabolomics technology of ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry and targeted metabolomics technology based on ultra-high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry, screens out 12 kinds of Sini Decoction anti-myocardial ischemia pharmacodynamics basis, and improves the anti-myocardial ischemia pharmacodynamics basis of Sini decoction. Accuracy shortens the screening cycle and reduces the cost of screening.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法。
技术介绍
四逆汤由附子、干姜、甘草组成，是张仲景所著《伤寒论》中的经典名方，具有回阳救逆的功效，现代常用于心肌缺血、心肌梗死和心力衰竭等心血管疾病。四逆汤因药力峻猛、疗效卓著一直受到历代医家的重视，研究发现附子中的乌头类生物碱、干姜中的姜辣素类化合物和总挥发油、甘草中的黄酮和皂苷类化合物是四逆汤中的主要化学成分。然而，四逆汤发挥心血管活性的真正药效成分是哪些？这些药效成分与生物活性之间的相互作用关系如何？这些是进一步研发安全有效、质量可控的四逆汤现代中药的基础。中药具有多成分、多途经、多靶点特点，其发挥作用是“系统(药物系统)-系统(生物系统)”的作用模式。挖掘中药药效成分是揭示中药科学内涵、指导临床合理用药的前提。生物效应导向的系统分离结合药效实验仍然是中药药效物质基础研究最常用的方法。但这种方法周期长、通量低，并且分解和忽视了中药“多组分-多靶点”整体作用的本质。而中药多组分“谱-效”研究大多局限于“多成分谱”与中药“单一效应”指标之间的“系统-点”的研究，仍然不能够反映中药通过多个成分与多个靶标共同作用的特征。另外，由于中药效应的多样性，导致药效指标选择的科学性与合理性也存在问题。因此有必要建立与中药“系统-系统”特点相适应的活性成分群研究新方法，为中药药效物质基础研究提供支撑。代谢组学作为系统生物学中的一门新兴“组学”，其核心思想是研究外源性物质对生物体代谢网络调控的整体效应，并以生物体内代谢小分子作为对象，研究药物对机体代谢组的系统作用。由于代谢组学是生物体所有基因、蛋白功能活动的终点，因而代谢组被视为生物体整体功能状态的“生化表型”，代谢组学发现的小分子标志物群能够即时、灵敏、真实地反映疾病或药物作用下生物体代谢网络的应答与调节，已成为药物治疗的潜在靶点，可作为药效评价的替代指标。中药血清药物化学以从口服方剂后的含药血清中分离鉴定中药药效物质基础的思路和研究设计，使研究结果体现中药成分的体内治疗状态，获得体现方剂治疗效应的体内直接作用物质，其理念及方法符合中药整体作用模式。中药血清药物化学研究方法为发现中药药效物质基础提供了方法学支撑。中药入血成分与中药药效之间必然存在关联性，可以利用相关分析将入血成分谱的峰面积(含量)与药效作用强度的动态变化联系起来，通过统计分析并通过生物学实验来确定众多成分中真正的有效成分。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法。该方法基于异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血模型，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UHPLC/Q-TOFMS)的非靶向代谢组学技术和基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPL/QQQ-MS)靶向代谢组学技术，筛选出12种四逆汤抗心肌缺血药效物质基础，提高了四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的准确性，缩短了筛选周期，减少了筛选耗费成本。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定步骤101、确定四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物：步骤1011、四逆汤的制备：分别称取60g附子、40干姜和60g甘草，然后加入1600mL纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热用四层纱布过滤，得到一次滤液和一次残渣，向一次残渣中加入1200mL纯净水煎煮1h，再次趁热用四层纱布过滤，得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液，经减压浓缩后得到浓度为1g/mL的四逆汤，即每毫升四逆汤相当于附子0.375g，干姜0.25g，甘草0.375g；步骤1012、样品的采集与制备：取雄性SD大鼠分成三组，分别为空白组、模型组和模型给药组，其中模型给药组口服给予四逆汤，四逆汤剂量为10mL溶液/1000g大鼠体重，空白组和模型组口服给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续10d，在第9d和第10d对模型给药组和模型组腹腔注射异丙肾上腺素制备心肌缺血模型，异丙肾上腺素剂量为85mg/1000g大鼠体重，对空白组腹腔注射同体积的生理盐水，各组每日注射1次，最后一次注射后的2h和4h时，各组均大鼠眼眶取血，然后在4℃、3000×g的条件下离心10min，得到的上清液为血清样品，将各组血清样品均在-70℃下保存；步骤1013、样品分析：将步骤1012中得到的各组血清样品冻融后各取100μL，分别加入400μL含有12.5μg/mL内标物L-2-氯丙苯氨酸的甲醇涡旋1min，然后均置于冰水浴中超声提取10min，再在4℃、14000×g的条件下离心15min，得到的上清液采用超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱进行检测分析，得到各组血清样品的数据，其中超高液相色谱分析的条件为：超高液相色谱采用Agilent1290Infinity液相色谱系统，色谱柱填料使用ACQUITYUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为40℃，流动相中的A相为甲酸质量含量0.1％的甲酸水溶液，B相为甲酸质量含量0.1％的甲酸乙腈溶液，流速为400μL/min，进样量为4μL，其中质谱条件为：质谱采用Agilent6530Accurate-MassQuadrupoleTime-of-Flight(Q-TOF)质谱仪，采用正离子模式检测，检测参数中的毛细管电压为3500V，干燥气流速为11L/min，干燥气温度为350℃，喷雾气压为45psig，破碎电压为120V，锥孔电压60V，数据采集范围质荷比m/z为50～1000；步骤1014、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定：首先根据步骤1013中各组血清样品的数据，对比空白组与模型组的内源性代谢物的变化，采用正交偏最小二乘法分析并确定模型组异常变化的内源性代谢物，然后以模型组异常变化的内源性代谢物为潜在的药效指标，对比模型组与模型给药组的异常变化的内源性代谢物，采用方差分析法分析四逆汤干预后异常变化的内源性代谢物中明显逆转的代谢物，确定了四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物；所述明显逆转的代谢物的方差分析结果中p<0.05；步骤102、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的峰面积的测定：步骤1021、采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱，通过多反应监测模式对步骤1014中确定的13种四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的特征离子进行扫描，得到相应的谱图；步骤1022、通过定量分析软件MassHunterQuantitativeAnalysis对步骤1021中得到的相应的谱图中的色谱峰面积进行积分，得到四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的含量信息；步骤二、四逆汤体内移行成分的确定和峰面积的测定步骤201、四逆汤体内移行成分的确定：根据步骤1013中各组血清样品的数据，分别建立空白组与模型组间的正交偏最小二乘法判别分析模型和空白组与模型给药组间的正交偏最小二乘法判别分析模型，然后以空白组与模型组间的正交偏最小二乘法判别分析模型权重载荷因子为横坐标，以空白组与模型给药组的正交偏最小二乘法判别分析模型权重因子为纵坐标，应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定步骤101、确定四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物：步骤1011、四逆汤的制备：分别称取60g附子、40干姜和60g甘草，然后加入1600mL纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热用四层纱布过滤，得到一次滤液和一次残渣，向一次残渣中加入1200mL纯净水煎煮1h，再次趁热用四层纱布过滤，得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液，经减压浓缩后得到浓度为1g/mL的四逆汤，即每毫升四逆汤相当于附子0.375g，干姜0.25g，甘草0.375g；步骤1012、样品的采集与制备：取雄性SD大鼠分成三组，分别为空白组、模型组和模型给药组，其中模型给药组口服给予四逆汤，四逆汤剂量为10mL溶液/1000g大鼠体重，空白组和模型组口服给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续10d，在第9d和第10d对模型给药组和模型组腹腔注射异丙肾上腺素制备心肌缺血模型，异丙肾上腺素剂量为85mg/1000g大鼠体重，对空白组腹腔注射同体积的生理盐水，各组每日注射1次，最后一次注射后的2h和4h时，各组均大鼠眼眶取血，然后在4℃、3000×g的条件下离心10min，得到的上清液为血清样品，将各组血清样品均在‑70℃下保存；步骤1013、样品分析：将步骤1012中得到的各组血清样品冻融后各取100μL，分别加入400μL含有12.5μg/mL内标物L‑2‑氯丙苯氨酸的甲醇涡旋1min，然后均置于冰水浴中超声提取10min，再在4℃、14000×g的条件下离心15min，得到的上清液采用超高效液相色谱/四极杆‑飞行时间质谱进行检测分析，得到各组血清样品的数据，其中超高液相色谱分析的条件为：超高液相色谱采用Agilent1290 Infinity液相色谱系统，色谱柱填料使用ACQUITY UPLC HSS T3 C18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为40℃，流动相中的A相为甲酸质量含量0.1％的甲酸水溶液，B相为甲酸质量含量0.1％的甲酸乙腈溶液，流速为400μL/min，进样量为4μL，其中质谱条件为：质谱采用Agilent 6530 Accurate‑Mass Quadrupole Time‑of‑Flight(Q‑TOF)质谱仪，采用正离子模式检测，检测参数中的毛细管电压为3500V，干燥气流速为11L/min，干燥气温度为350℃，喷雾气压为45psig，破碎电压为120V，锥孔电压60V，数据采集范围质荷比m/z为50～1000；步骤1014、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定：首先根据步骤1013中各组血清样品的数据，对比空白组与模型组的内源性代谢物的变化，采用正交偏最小二乘法分析并确定模型组异常变化的内源性代谢物，然后以模型组异常变化的内源性代谢物为潜在的药效指标，对比模型组与模型给药组的异常变化的内源性代谢物，采用方差分析法分析四逆汤干预后异常变化的内源性代谢物中明显逆转的代谢物，确定了四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物；所述明显逆转的代谢物的方差分析结果中p...

【技术特征摘要】
1.一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定步骤101、确定四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物：步骤1011、四逆汤的制备：分别称取60g附子、40干姜和60g甘草，然后加入1600mL纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热用四层纱布过滤，得到一次滤液和一次残渣，向一次残渣中加入1200mL纯净水煎煮1h，再次趁热用四层纱布过滤，得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液，经减压浓缩后得到浓度为1g/mL的四逆汤，即每毫升四逆汤相当于附子0.375g，干姜0.25g，甘草0.375g；步骤1012、样品的采集与制备：取雄性SD大鼠分成三组，分别为空白组、模型组和模型给药组，其中模型给药组口服给予四逆汤，四逆汤剂量为10mL溶液/1000g大鼠体重，空白组和模型组口服给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续10d，在第9d和第10d对模型给药组和模型组腹腔注射异丙肾上腺素制备心肌缺血模型，异丙肾上腺素剂量为85mg/1000g大鼠体重，对空白组腹腔注射同体积的生理盐水，各组每日注射1次，最后一次注射后的2h和4h时，各组均大鼠眼眶取血，然后在4℃、3000×g的条件下离心10min，得到的上清液为血清样品，将各组血清样品均在-70℃下保存；步骤1013、样品分析：将步骤1012中得到的各组血清样品冻融后各取100μL，分别加入400μL含有12.5μg/mL内标物L-2-氯丙苯氨酸的甲醇涡旋1min，然后均置于冰水浴中超声提取10min，再在4℃、14000×g的条件下离心15min，得到的上清液采用超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱进行检测分析，得到各组血清样品的数据，其中超高液相色谱分析的条件为：超高液相色谱采用Agilent1290Infinity液相色谱系统，色谱柱填料使用ACQUITYUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为40℃，流动相中的A相为甲酸质量含量0.1％的甲酸水溶液，B相为甲酸质量含量0.1％的甲酸乙腈溶液，流速为400μL/min，进样量为4μL，其中质谱条件为：质谱采用Agilent6530Accurate-MassQuadrupoleTime-of-Flight(Q-TOF)质谱仪，采用正离子模式检测，检测参数中的毛细管电压为3500V，干燥气流速为11L/min，干燥气温度为350℃，喷雾气压为45psig，破碎电压为120V，锥孔电压60V，数据采集范围质荷比m/z为50～1000；步骤10...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭光国，周倩，孟平，王海波，陈鹏，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61