石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法技术

本方案公开了植物真菌中提取化合物的技术领域，石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，该方法从石斛兰植物中分离出内生真菌菌株，将内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿再次溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤得到胞内石斛碱；代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿再次溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤得到胞外石斛碱。本发明专利技术首次从石斛兰的内生真菌中提取分离出石斛碱，扩大了石斛碱的来源。

Extraction of Dendrobium alkaloids from endophytic fungi of Dendrobium

The scheme discloses the technical field of extracting compounds from plant fungi, the extraction method of Dendrobium endophytic fungi intracellular and extracellular Dendrobium alkali. The method separates endophytic fungi strains from Dendrobium plants, isolates endophytic fungi strains and metabolites, and freeze-dries the isolated endophytic fungi strains; grinds the frozen-dried endophytic fungi strains into powder. The final form is transferred to centrifugal tube after immersion in chloroform for centrifugal separation; the separated chloroform phase evaporates at 34-36 (?) C to obtain residues; the residues are dissolved again in chloroform and filtered through a filter with a pore size of 0.22 mm to obtain intracellular Dendrobium alkali; the metabolites are separated by centrifugation after mixing with chloroform, and the separated chloroform phase evaporates at 34-36 (?) C to obtain residues. The residues were dissolved again in chloroform and filtered through a filter with a pore size of 0.22 mm to obtain extracellular Dendrobium alkali. The invention extracts and separates Dendrobium alkaloids from endophytic fungi of Dendrobium for the first time, and expands the source of Dendrobium alkaloids.

【技术实现步骤摘要】
石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法
本专利技术涉及植物内生真菌中提取分离化合物的
，具体涉及一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法。
技术介绍
近年来，植物内生真菌的研究备受关注，内生真菌生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同演化，在演化过程中二者形成互惠共生关系，一方面内生真菌可以从宿主中吸收营养供给自己生长需要，另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程以及抗植物病虫害中起着重要的作用。据报道，一些内生真菌中还可发现有药用植物所产生的活性物质。石斛碱是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱，是从兰科植物石斛兰(DendrobiumnobileLindl)的茎中提取分离得到，也是石斛兰的主要药用活性成分。石斛碱具有解热、眼部矫正、炎症调节、保护胃肠粘膜损伤和抗衰老剂等多种药用价值。抑制A549细胞的生长，这与肺癌有关，有显著的治疗甲型H1N1流感等病毒感染的效果，因此，对其进行研究开发具有较高的临床价值。石斛兰在中国传统药用植物中得到了广泛的应用，而目前关于石斛碱的获取，主要集中在植物提取和化学合成技术方面，石斛兰的石斛碱活性成分在医药、化工等领域引起了越来越多的关注，但在植物中，石斛碱的生产量却很少。然而，目前大多数的研究者和研究课题都关注于草本中的石斛碱，由于技术上的局限性，目前还没有对石斛兰中分离出来的内生真菌中的石斛碱提取分离进行研究。
技术实现思路
本专利技术意在提供一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，以解决目前还未有从石斛兰内生菌中获取石斛碱的技术问题。本方案中的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；步骤3)、胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。本专利技术的有益效果是：本专利技术先对石斛兰植株表面进行灭绝操作，避免从石斛兰内部分离出来的内生真菌含有杂菌而影响内生真均的生长繁殖。对分离出来的内生真菌进行孵化获得内生真菌菌株，孵化过程中产生的代谢产物与内生真菌菌株进行分离，以便于独立的从内生真菌菌株和代谢产物中提取出石斛碱。分离后的菌体进行冷冻干燥，菌体在冷冻环境下处于冷冻状态，然后在真空减压情况下利用升华现象除去水分，使菌体在非剧烈的，尽量避免细胞直接受损的条件下处于干燥、缺氧状态，使其生理活动受到抑制，进而避免在进行胞内提取石斛碱之前菌体再产生代谢产物，确保了胞内提取石斛碱完全来自菌体细胞而非代谢产物，确保验证石斛碱存在的准确性。使用氯仿将石斛碱溶解出来，将氯仿相进行蒸发过滤既得目标成分石斛碱。本专利技术首次从石斛兰的内生真菌内及其代谢产物中提取分离出石斛碱，扩大了石斛碱的来源。优化方案一，所述内生真菌的分离步骤中石斛兰进行表面灭菌的方法是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒28～32min，取出，最后再紫外照射18～22s。优化方案二，所述内生真菌的分离步骤中所述培养基为马铃薯葡萄糖培养基，培养基的pH值为6.4。优化方案三，所述内生真菌的分离步骤中孵化温度为25℃，时间为5天。优化方案四，所述内生真菌的分离步骤分离出的内生真菌菌株接种到另一培养基中，再于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min。优化方案五，所述胞内石斛碱的提取步骤中100mg冻干内生真菌菌体粉末，采用50mL的氯仿浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。优化方案六，所述胞外石斛碱的提取步骤中代谢产物与氯仿的容积比为1:1；浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。附图说明图1为本专利技术石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法及石斛碱检测的流程图；图2本专利技术中石斛碱检测结果的示意图；图3为本专利技术石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取流程图；图4为本专利技术采用GC-MS检测80ng/mL标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；图5为本专利技术采用GC-MS检测20μg/mL标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；图6为本专利技术采用GC-MS检测空白组(培养基+氯仿)中石斛碱的分子量的色谱图；图7为本专利技术采用GC-MS检测石斛兰内生真菌——长柄木霉细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图8为本专利技术采用GC-MS检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图9为本专利技术采用GC-MS检测石斛兰内生真菌——热带炭疽菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图10为本专利技术采用LC-MS检测20ng/mL标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；图11为本专利技术采用LC-MS检测80ng/mL标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；图12为本专利技术采用LC-MS检测空白组(培养基+氯仿)中石斛碱的分子量的色谱图；图13为本专利技术采用LC-MS检测石斛兰内生真菌——长柄木霉细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图14为本专利技术采用LC-MS检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图15为本专利技术采用LC-MS检测石斛兰内生真菌——热带炭疽菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；图16为本专利技术采用LC-MS检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞外(代谢产物)石斛碱的分子量的色谱图。图17为本专利技术采用GC-MS检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞外(代谢产物)石斛碱的分子量的色谱图。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细的说明：实施例1：石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理，处理方式是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒30min，取出，最后再紫外照射20s；灭菌处理的石斛兰接种到pH值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，在25℃孵化5天，然后根据形态学和DNA测序确定分离出内生真菌菌株；内生真菌菌株再接种到另一pH值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min；步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥使用ModulyoD-230冷冻干燥机(热电子公司,米尔福米,MA)，669mbar干燥10小时；步骤3)、胞内石斛碱的提取：秤取100mg冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，并加入50mL的氯仿试剂浸泡12h，然后再转移至离心管中进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min，分离后的氯仿相，使用旋转蒸发器(旋转蒸发器N-1300V-W，EYELA，美国)在35℃下蒸发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；步骤3)胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。

【技术特征摘要】
1.石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；步骤3)胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。2.根据权利要求1所述的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中石斛兰进行表面灭菌的方法是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0...

【专利技术属性】
技术研发人员：萨尔赛亚·萨仁德勒，陈集双，石京山，贾启，阿查娜·简，樊小宽，舒福兴，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52