同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法技术

本发明专利技术公开了同时表达ETX‑CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法。本发明专利技术重组菌的构建方法包括：将融合蛋白ETX‑CSA的编码基因导入大肠杆菌，得到表达融合蛋白的重组菌；连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第297‑311位。本发明专利技术方法仅发酵一株菌即可同时获得两种毒素蛋白，将其制苗后可同时预防两种疾病。将其与C型产气荚膜梭菌类毒素制成联苗后能产生优异的免疫效果，三组分(S、C、D)的家兔血清效价分别可提高至规程标准的3、4、10倍。本发明专利技术方法稳定性好、耗时短、成本低，其中S、D组分的成本降为传统工艺的1/100，三组分(S、C、D)的效价成本比可分别提高为传统工艺的344、4、993倍。

Production of Recombinant Bacteria Expressing ETX-CSA and Related Vaccines

The invention discloses a production method of recombinant bacteria expressing ETX CSA and related vaccines simultaneously. The construction method of the recombinant bacteria includes: introducing the coding gene of the fusion protein ETX CSA into E. coli to obtain the recombinant bacteria expressing the fusion protein; and the amino acid sequence of the connecting peptide is 297 311 of SEQ ID No.1. The method of the invention can obtain two toxin proteins at the same time by fermenting only one strain of bacteria, and can prevent two diseases at the same time after making seedlings. The combined vaccine with C-type Clostridium perfringens toxoid can produce excellent immune effect. The serum titers of the three components (S, C and D) can be increased to 3, 4 and 10 times of the standard, respectively. The method of the invention has good stability, short time consumption and low cost, in which the cost of S and D components is reduced to 1/100 of the traditional process, and the cost-effectiveness ratio of the three components (S, C and D) can be increased to 344, 4 and 993 times of the traditional process, respectively.

【技术实现步骤摘要】
同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种同时表达ETX(产气荚膜梭菌ε毒素)-CSA(腐败梭菌α毒素)的重组菌及相关疫苗的生产方法。
技术介绍
羊快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症是分别由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌和D型产气荚膜梭菌引起的羊常见多发性传染病(陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社,2013:192-202.)，它们常常合并发生，病程急剧，发病动物常常不出现症状即行死亡，死亡率高，危害大。因此，免疫接种是控制这些疫病的唯一有效途径。欧美、澳大利亚等畜牧业发达国家均把牛羊的四种疫病作为必须免疫预防的疫病，并有多种含有预防这些疫病成分的疫苗投放市场(AnimalandPlantHealthInspectionService,USDA.9CFRCh.I(1-1-07Edition)[S].Washington:U.S.GOVERNMENTPRINTINGOFFICE,2007.BritishPharmacopoeia(Veterinary)[S].London:TheStationeryOffice,2005.)。我国也采取免疫接种的方法预防这些疫病并取得了良好的效果。我国目前用于预防这些疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗)和羊梭菌病多联干粉疫苗(干粉苗)(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典.2010版,三部[S].北京：中国农业出版社,2011.农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程,2000版[S].北京：化学工业出版社,2000.)，在该类疾病的控制方面发挥了积极作用。据2015年批签发统计，年产量达2.5亿头份，但实际需要远大于此。年产值约2500万元到3000万元。然而，目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基，用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象，这影响了疫苗的质量，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。并且，笔者在2006年到2015年之间以血清中和法进行效力检验结果不合格的33批产品中，有15批产品的腐败梭菌组分效价不合格、有21批产品的C型产气荚膜梭菌组分效价不合格，有13批产品的D型产气荚膜梭菌组分效价不合格。腐败梭菌α毒素(CSA)和产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)分别是腐败梭菌和D型产气荚膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保护性抗原，以大肠杆菌表达系统分别获得这两种重组毒素蛋白，单组分经制成单苗后分别免疫动物均可产生针对各自毒素的有效免疫保护(AmimotoK,OhgitaniT,SasakiO,etal.ProtectiveeffectofClostridiumsepticumalpha-toxoidvaccineagainstchallengewithsporesinguineapigs[J].JVetMedSci,2002,64(1):67-69.LanctoCA,FosterLK,KrommMM,etal.AnoncytolyticαtoxinrecombinantproteinprotectsturkeysagainstClostridiumsepticumchallenge[J].AvianDis,2014,58(4):566-571.MarcosRobertoAFerreira,GustavoSGMoreira,CarlosEduardoPdaCunha,etal.RecombinantAlpha,Beta,andEpsilonToxinsofClostridiumperfringens:ProductionStrategiesandApplicationsasVeterinaryVaccines[J].Toxins,2016,340(8):1-24.)。因此，研发出成本价廉、培养工艺稳定、免疫效果确实的重组亚单位疫苗及生产方法显得尤为必要和迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法。第一方面，本专利技术要求保护能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法。本专利技术所提供的能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法，可包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌，即为所述工程菌；所述融合蛋白为将产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素通过连接肽连接而成；所述连接肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1的第297-311位。进一步地，所述产气荚膜梭菌ε毒素可为如下(A1)-(A3)中任一所示的蛋白质：(A1)SEQIDNo.1的第1-296位所示的蛋白质；(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。进一步地，所述腐败梭菌α毒素可为如下(B1)-(B3)中任一所示的蛋白质：(B1)SEQIDNo.1的第312-720位所示的蛋白质；(B2)将(B1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。进一步地，所述融合蛋白可为如下(C1)-(C4)中任一所示的蛋白质：(C1)SEQIDNo.1所示的蛋白质；(C2)将(C1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(C3)与(C1)或(C2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(C4)在(C1)-(C3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因中编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的基因具体可为如下(a1)-(a3)中任一所示的DNA分子：(a1)核苷酸序列如SEQIDNo.2的第1-888位所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子。相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因中编码所述腐败梭菌α毒素的基因具体可为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列如SEQIDNo.2的第934-2163位所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌，即为所述工程菌；所述融合蛋白为将产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素通过连接肽连接而成；所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第297‑311位。

【技术特征摘要】
1.能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌，即为所述工程菌；所述融合蛋白为将产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素通过连接肽连接而成；所述连接肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1的第297-311位。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产气荚膜梭菌ε毒素为如下(A1)-(A3)中任一所示的蛋白质：(A1)SEQIDNo.1的第1-296位所示的蛋白质；(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述腐败梭菌α毒素为如下(B1)-(B3)中任一所示的蛋白质：(B1)SEQIDNo.1的第312-720位所示的蛋白质；(B2)将(B1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述融合蛋白为如下(C1)-(C4)中任一所示的蛋白质：(C1)SEQIDNo.1所示的蛋白质；(C2)将(C1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(C3)与(C1)或(C2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(C4)在(C1)-(C3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因中编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的基因为如下(a1)-(a3)中任一所示的DNA分子：(a1)核苷酸序列如SEQIDNo.2的第1-888位所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子；和/或所述融合蛋白的编码基因中编码所述腐败梭菌α毒素的基因为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列如SEQIDNo.2的第934-2163位所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子；和/或所述融合蛋白的编码基因中编码所述连接肽的基因的核苷酸序列为SEQIDNo.2的第889-933位；和/或所述融合蛋白的编码基因为如下(c1)-(c3)中任一所示的DNA分子：(c1)核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的DNA分子；(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；(c3)与(c1)或(c2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭小兵，蒋玉文，杜吉革，李旭妮，彭国瑞，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11