蛋白质及基因的应用、以及重组载体、表达盒、重组菌及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质及其基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。该蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。通过敲除大丽轮枝菌中的该基因使大丽轮枝菌的致病性降低。与野生型大丽轮枝菌相比，敲除该基因的大丽轮枝菌突变体侵染的棉花黄萎病发病率、病情指数和病级数均有降低。

Application of Protein and Gene, Recombinant Vector, Expression Box, Recombinant Bacteria and Construction Method

The invention relates to the application of a protein and its gene in influencing the pathogenicity of Verticillium dahliae, as well as a recombinant vector, an expression box, a recombinant bacterium containing or knocking out the gene and a construction method thereof. The protein is as follows: 1) amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 2; 2) amino acid sequence of SEQ ID NO. 2 is substituted and/or deleted by one or more amino acid residues and/or added by a 1) derived protein associated with the pathogenesis of Rhizobium dahliae. By knocking out the gene in Verticillium dahliae, the pathogenicity of Verticillium dahliae was reduced. Compared with wild-type Verticillium dahliae, the incidence, disease index and disease progression of Verticillium wilt in cotton infected by the mutant of Verticillium dahliae which knocked out the gene were lower.

【技术实现步骤摘要】
蛋白质及基因的应用、以及重组载体、表达盒、重组菌及构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种蛋白质及其基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。
技术介绍
棉花黄萎病是一种土壤传播的维管束病害，其具有分布广，危害重，存活时间长，化学农药难于防治等特点，是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一，严重威胁着棉花的生产和发展。我国棉花黄萎病主要是由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)所引起的。大丽轮枝菌属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属，其寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益，1992)，1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993，1995，1996，2002年在全国范围内连续大发生，导致我国棉花产业损失严重。我国是棉花生产大国，全国棉花种植面积近亿亩，棉产量占全球棉花总产量的四分之一。然而，我国每年因为棉花黄萎病引起的棉花减产问题非常严重，给棉农及国家造成了很大的经济损失，并已成为当前制约我国棉花生产的突出问题。由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年，李成葆等对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了126个海岛棉品种的抗性，结果显示表现耐病和抗病的占85％。目前通过分子生物学手段己经克隆的植物抗病基因大概有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通锈病(PucciniaSorghi)基因Rpl-D，且在海岛棉上已经克隆了NBS-LRR类抗病基因。但都并没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究。此外，大丽轮枝菌小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。所以，进一步深入研究大丽轮枝菌致病性的分子机理也就具备重要意义，且可为抗棉花黄萎病寻找新的防治措施奠定基础。NADPH氧化酶(Nox)产生的活性氧(ROS)在多细胞真核生物中主要参与宿主的免疫或防卫、细胞增殖与分化、信号传导及离子运输等过程。Nox是由gp91phox、p22phox、p47phox、p40phox、p67phox和小G蛋白Rac(smallGTpase)亚基组成的多组分复合物，最初是在吞噬细胞中发现了它的表达。吞噬细胞的催化亚基gp91phox(又称为Nox2)和调节亚基p22phox在细胞膜上形成异二聚体，当与细胞质中的p47phox、p40phox、p67phox和小G蛋白Rac结合时可形成有活性的复合物。gp91phox是其主要的功能亚基。在真菌中，gp91phox的同源蛋白为NoxA/NoxB(或者写为Nox1/Nox2，不同的参考文献写法不一)，p67phox的同源蛋白为NoxR，p22phox的同源蛋白为NoxD。在过去的研究中，通过比较野生型大丽轮枝菌V592和VdNoxB及VdPls1敲除突变体的侵染过程，发现大丽轮枝菌在紧密接触到宿主根表皮细胞时会分化形成顶端膨大的附着枝，并发育出侵染钉，VdNoxB和VdPls1在附着枝特异表达；VdNoxB及VdPls1敲除突变体的附着枝不能形成侵染钉，从而丧失了穿透植物细胞壁的能力和在棉花上的致病力。进一步实验表明VdPls1和VdNoxB在侵染钉细胞膜上形成复合物并通过在尖端产生活性氧调控侵染钉的发育。而揭示NoxR在真菌中生物学作用的研究工作才刚起步，NoxR亚基在大丽轮枝菌的侵染机制中是否有作用尚无报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种蛋白质(VdNoxR)及其基因(VdNoxR)在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。该蛋白质及其基因与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系，通过敲除该基因可以降低大丽轮枝菌的致病性。该致病性为致黄萎病性。VdNoxR来自大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)。本专利技术提供了VdNoxR蛋白在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本专利技术还提供了VdNoxR基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述基因为编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因。优选地，上述基因为如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQIDNO.1中自5′末端第1-15位；第367-702位；第753-914位；第973-1890位；第1947-1967位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因；3)在严格条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因。序列表中SEQIDNO.1由1967个脱氧核苷酸组成，自5’端第1-15位；第367-702位；第753-914位；第973-1890位；第1947-1967位为ORF区编码SEQIDNO.2中所述氨基酸残基序列的蛋白质。所述“严格条件”为足以使核苷酸序列与SEQIDNO.1所示的基因序列杂交的条件，这些条件对本领域技术人员是公知的，例如：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。更优选地，敲除所述大丽轮枝菌中的上述基因，使所述大丽轮枝菌致病性降低。具体地，上述应用包括以下步骤：(1)将含有所述基因上游和下游序列的载体转化农杆菌，所述基因上游序列如SEQIDNO.3所示，所述基因下游序列如SEQIDNO.4所示；(2)筛选转化成功的所述农杆菌；(3)转化成功的所述农杆菌转染所述大丽轮枝菌；(4)筛选敲除成功的所述大丽轮枝菌。本专利技术还提供了一种重组载体，其含有以下一种或多种基因：编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因；SEQIDNO.1所示的基因；SEQIDNO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。本专利技术还提供了一种重组载体，其为能够敲除以下一种或多种基因的重组载体：编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因，SEQIDNO.1所示的基因，SEQIDNO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。2.一种基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述基因为编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因，优选地，所述基因为如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQIDNO.1中自5′末端第1-15位；第367-702位；第753-914位；第973-1890位；第1947-1967位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因；3)在严格条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因。3.根据权利要求2所述的应用，其包括：敲除所述大丽轮枝菌中的所述基因。4.根据权利要求3所述的应用，其包括：(1)将含有所述基因上游和下游序列的载体转化农杆菌，所述基因上游序列如SEQIDNO.3所示，所述基因下游序列如SEQIDNO.4所示；(2)筛选转化成功的所述农杆菌；(3)转化成功的所述农杆菌转染所述大丽轮枝菌；(4)筛选敲除成功的所述大丽轮枝菌。5.一种重组载体，其特征在于，其含有以下一种或多种基因：编码SEQIDNO.2所示蛋白质的基因；SEQIDNO.1所示的基因；SEQIDNO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。6.一种重组载体，其为能...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭惠珊，房媛媛，周婷婷，张涛，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11