一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法。本发明专利技术的杂交兜兰(Paphiopedilum Kamioka为母本、杏黄兜兰(Paphiopedilum armeniacum)为父本)无性克隆高效繁殖方法，包括经过类原球茎和芽的混合体增殖和分化再经芽进行增殖的方法和直接以芽进行增殖的方法；本发明专利技术的杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法可为发展兜兰产业提供大量优质标准的种苗，对促进兜兰产业在我国的发展具有积极的推动作用。

A High Efficient Propagation Method for Clone of Hybrid Cymbidium

The invention discloses an efficient reproduction method of clonal clone of hybrid Aristolochia elata. The present invention relates to an efficient clonal propagation method of hybrid Paphiopedilum (Kamioka as female parent and Paphiopedilum armeniacum as male parent), including a method of multiplication and differentiation through a mixture of protocorm and bud, and then bud multiplication, and a method of direct bud multiplication; the efficient clonal propagation method of hybrid Paphiopedilum can be used to develop the industry of Paphiopedilum. Providing a large number of high quality standard seedlings has a positive role in promoting the development of Aristolochia industry in China.

【技术实现步骤摘要】
一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法。
技术介绍
兜兰，又称拖鞋兰、仙履兰等，兰科(Orchidaceae)杓兰亚科(SubfamilyCypripediodeae)兜兰属(Paphiopedilum)植物的总称。兜兰属植物唇瓣兜状，颜色多样，显得十分奇异与惊艳，是花卉中的高档产品。兜兰杂交种的繁殖可用种子进行无菌播种，但是种子来源有限，萌发率常较低，萌发需要时间长，杂交后代出现性状分离难以得到均一的种苗；而采取单个原球茎增殖并分化得到的类原球茎和芽的混合体再增殖和分化来获取大量的丛生芽，有利于获得均一性状的杂交后代，从而实现其规模化、商品化生产，还可以缩短培养周期，繁殖效率高，降低生产成本。目前国内外关于兜兰属植物的组培快繁技术的研究报道较少，报道较多的是通过无菌播种获得种苗，通过组织培养进行类原球茎和芽增殖获得种苗的报道非常少。并且如曾宋君写的文献综述《兜兰无菌播种和组织培养研究进展》，通过类原球茎和芽增殖的兜兰组织培养报道均是使用细胞分裂素和生长素刺激类原球茎和芽增殖。兜兰无菌播种和组织培养采用的蔗糖浓度通常是20-30g/L，以1/2MS为基本培养基。杏黄兜兰(Paphiopedilumarmeniacum)，花型端正，色泽金黄，尤为珍贵，在世界上享有盛誉。然而，利益驱使下的盗挖盗采以及生境的破坏，使得杏黄兜兰的种群数量急剧减少，濒临灭绝。PaphiopedilumKamioka是同色兜兰和带叶兜兰的杂交后代，由中国科学院华南植物园育成。文献《InvitropropagationofPaphiopedilumhangianumPerner&Gruss》报道汉氏兜兰1/2MS+20g/L蔗糖为基本培养基，类原球茎在1mg/LBA和5mg/LKT条件下90天的增殖系数达到5.2左右，芽在1mg/LBA和2mg/LNAA条件下增殖系数达到3.8左右，可以看出类原球茎增殖系数比芽增殖系数大。公开号为CN105494103A、名称为“一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法”的国内专利技术专利公开了一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，内容包括外植体消毒，不定芽诱导和丛生芽增殖，生根壮苗培养和试管苗移栽；该技术未能通过类原球茎增殖而是通过丛生芽增殖，很可能是因为不定芽诱导和丛生芽增殖使用1/2MS+20-30g/L蔗糖为基本培养基，其报道的增殖系数为2.5-3.0，如果能用合适的方法以类原球茎增殖，可能其中的材料的类原球茎的增殖系数比芽的增殖系数要高很多。目前，国内外还没有未使用细胞分裂素的兜兰类原球茎和芽的混合体增殖技术研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂交兜兰(PaphiopedilumKamioka为母本、杏黄兜兰(Paphiopedilumarmeniacum)为父本)无性克隆高效繁殖方法。本专利技术的杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法，包括以下步骤：a.无菌播种：取杂交兜兰果实消毒后将种子接种到种子萌发培养基上培养，待种子萌发形成原球茎时将其单个分开，继续培养，原球茎增殖并分化成类原球茎和芽的混合体；所述的种子萌发培养基：为1/8-1/4MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、2-5g/L蛋白胨、0.5-1.5g/L活性炭、5-15g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；b.类原球茎和芽的混合体增殖：将类原球茎和芽的混合体切成包含4-8个类原球茎和3-6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的增殖培养基上，进行增殖培养；所述的类原球茎和芽的混合体的增殖培养基：为1/8-1/4MS培养基添加、20-100mL/L椰子乳、2-5g/L蛋白胨、5-10g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；c.类原球茎和芽的混合体分化：将类原球茎和芽的混合体切成包含4-8个类原球茎和3-6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的分化培养基上，进行分化培养；所述的类原球茎和芽的混合体的分化培养基：为1/2-1MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、20-25g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；d.不定芽诱导和丛生芽增殖：将分化培养后的类原球茎和芽的混合体切成每团2-4个芽，接种在不定芽诱导和丛生芽增殖培养基上培养，诱导不定芽和丛生芽增殖伸长；所述的不定芽诱导和丛生芽增殖培养基：为1/2-1MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、20-25g/L蔗糖、0.2-0.4mg/LNAA、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；e.生根壮苗培养：将大于或等于1.5cm长的芽从芽团中分离出来接种在生根壮苗培养基上培养，得到生根苗；所述的生根壮苗培养基：为1/2MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、50-100g/L香蕉匀浆、5-20g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4、0.5-1.5mg/LNAA、0.5-2.0g/L活性炭和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0。优选，所述的步骤a-e中的培养条件为：培养温度25-29℃，光照强度1500-2000lx，光照时间12-16h/d。优选，所述的杂交兜兰是以PaphiopedilumKamioka为母本、杏黄兜兰(Paphiopedilumarmeniacum)为父本杂交获得的。本专利技术还提供一种以芽进行增殖的杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法，包括以下步骤：a.无菌播种：取杂交兜兰果实消毒后将种子接种到种子萌发培养基上培养，待种子萌发形成原球茎时将其单个分开，继续培养，原球茎增殖并分化成类原球茎和芽的混合体；所述的种子萌发培养基：为1/8-1/4MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、2-5g/L蛋白胨、0.5-1.5g/L活性炭、5-15g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；b.不定芽诱导和丛生芽增殖：将类原球茎和芽的混合体切成每团2-4个芽，接种在不定芽诱导和丛生芽增殖培养基上培养，诱导不定芽和丛生芽增殖伸长；所述的不定芽诱导和丛生芽增殖培养基：为1/2-1MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、20-25g/L蔗糖、0.2-0.4mg/LNAA、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；c.生根壮苗培养：将大于或等于1.5cm长的芽从芽团中分离出来接种在生根壮苗培养基上培养，得到生根苗；所述的生根壮苗培养基：为1/2MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、50-100g/L香蕉匀浆、5-20g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4、0.5-1.5mg/LNAA、0.5-2.0g/L活性炭和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0。优选，所述的步骤a-c中的培养条件为：培养温度25-29℃，光照强度1500-2000lx，光照时间12-16h/d。优选，所述的杂交兜兰是以PaphiopedilumKamioka为母本、杏黄兜兰(Paphiopedi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：a.无菌播种：取杂交兜兰果实消毒后将种子接种到种子萌发培养基上培养，待种子萌发形成原球茎时将其单个分开，继续培养，原球茎增殖并分化成类原球茎和芽的混合体；所述的种子萌发培养基：为1/8‑1/4MS培养基添加20‑100mL/L椰子乳、2‑5g/L蛋白胨、0.5‑1.5g/L活性炭、5‑15g/L蔗糖、0.1‑0.3g/L NaH2PO4和4.5‑5.0g/L琼脂，pH 5.8‑6.0；b.类原球茎和芽的混合体增殖：将类原球茎和芽的混合体切成包含4‑8个类原球茎和3‑6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的增殖培养基上，进行增殖培养；所述的类原球茎和芽的混合体的增殖培养基：为1/8‑1/4MS培养基添加、20‑100mL/L椰子乳、2‑5g/L蛋白胨、5‑10g/L蔗糖、0.1‑0.3g/L NaH2PO4和4.5‑5.0g/L琼脂，pH 5.8‑6.0；c.类原球茎和芽的混合体分化：将类原球茎和芽的混合体切成包含4‑8个类原球茎和3‑6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的分化培养基上，进行分化培养；所述的类原球茎和芽的混合体的分化培养基：为1/2‑1MS培养基添加20‑100mL/L椰子乳、20‑25g/L蔗糖、0.1‑0.3g/L NaH2PO4和4.5‑5.0g/L琼脂，pH 5.8‑6.0；d.不定芽诱导和丛生芽增殖：将分化培养后的类原球茎和芽的混合体切成每团2‑4个芽，接种在不定芽诱导和丛生芽增殖培养基上培养，诱导不定芽和丛生芽增殖伸长；所述的不定芽诱导和丛生芽增殖培养基：为1/2‑1MS培养基添加20‑100mL/L椰子乳、20‑25g/L蔗糖、0.2‑0.4mg/L NAA、0.1‑0.3g/L NaH2PO4和4.5‑5.0g/L琼脂，pH 5.8‑6.0；e.生根壮苗培养：将大于或等于1.5cm长的芽从芽团中分离出来接种在生根壮苗培养基上培养，得到生根苗；所述的生根壮苗培养基：为1/2MS培养基添加20‑100mL/L椰子乳、50‑100g/L香蕉匀浆、5‑20g/L蔗糖、0.1‑0.3g/L NaH2PO4、0.5‑1.5mg/L NAA、0.5‑2.0g/L活性炭和4.5‑5.0g/L琼脂，pH 5.8‑6.0。...

【技术特征摘要】
1.一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：a.无菌播种：取杂交兜兰果实消毒后将种子接种到种子萌发培养基上培养，待种子萌发形成原球茎时将其单个分开，继续培养，原球茎增殖并分化成类原球茎和芽的混合体；所述的种子萌发培养基：为1/8-1/4MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、2-5g/L蛋白胨、0.5-1.5g/L活性炭、5-15g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；b.类原球茎和芽的混合体增殖：将类原球茎和芽的混合体切成包含4-8个类原球茎和3-6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的增殖培养基上，进行增殖培养；所述的类原球茎和芽的混合体的增殖培养基：为1/8-1/4MS培养基添加、20-100mL/L椰子乳、2-5g/L蛋白胨、5-10g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；c.类原球茎和芽的混合体分化：将类原球茎和芽的混合体切成包含4-8个类原球茎和3-6个芽的小团，接种到类原球茎和芽的混合体的分化培养基上，进行分化培养；所述的类原球茎和芽的混合体的分化培养基：为1/2-1MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、20-25g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；d.不定芽诱导和丛生芽增殖：将分化培养后的类原球茎和芽的混合体切成每团2-4个芽，接种在不定芽诱导和丛生芽增殖培养基上培养，诱导不定芽和丛生芽增殖伸长；所述的不定芽诱导和丛生芽增殖培养基：为1/2-1MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、20-25g/L蔗糖、0.2-0.4mg/LNAA、0.1-0.3g/LNaH2PO4和4.5-5.0g/L琼脂，pH5.8-6.0；e.生根壮苗培养：将大于或等于1.5cm长的芽从芽团中分离出来接种在生根壮苗培养基上培养，得到生根苗；所述的生根壮苗培养基：为1/2MS培养基添加20-100mL/L椰子乳、50-100g/L香蕉匀浆、5-20g/L蔗糖、0.1-0.3g/LNaH2PO4、0.5-1.5mg/LNAA、0.5-2.0g/L活性炭和4.5-5.0g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛创学，吴坤林，曾宋君，郑枫，房林，李琳，周依清，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44