一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，包括以下步骤：步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液样品；步骤(2)在垂直电泳槽内制备分离胶，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；步骤(3)在浓缩胶的样品槽中点样后，对垂直电泳槽施加电压，跑胶；步骤(4)利用割胶板将样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶，保留分离胶，即获得包含样品的条状分离胶；将包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；步骤(5)将孵育后的包含样品的条状分离胶紧密贴在培养皿中的底物胶的胶面上，将培养皿放置在30‑50℃的生化培养箱中，培养1‑36小时，直至有清晰的条带和透明圈出现。本发明专利技术中操作简单，且采用同一块胶，能够同时鉴定出木聚糖酶蛋白条带及活性。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法
本专利技术涉及检测
，更具体的说是涉及一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法。
技术介绍
木聚糖是一种植物细胞壁多糖，约占植物细胞干物质的15-35％，是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于秸秆、麦麸、玉米芯等农业副产物中，含量非常丰富。通过木聚糖酶可将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，进而使这些资源被充分利用，发挥其潜在的应用价值。木聚糖酶已广泛应用于饲料、食品、造纸和能源等领域，带来了很大的经济效益。目前木聚糖酶的生产主要来源于微生物发酵，包括自然界中分泌木聚糖酶的微生物以及利用基因工程技术构建的含重组木聚糖酶基因的工程菌(陈洪洋等，木聚糖酶的研究进展，中国酿造，2016(11)：1-5)。在利用微生物生产木聚糖酶过程中，往往需要对木聚糖酶的特性、活性、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶(Native-Page)中的位置、以及是否存在同工酶等情况进行鉴定，以便与木聚糖酶的纯化，这需要酶谱技术。酶谱技术是利用电泳技术结合特异的酶促化学反应显色对酶及其同工酶进行分析的方法。根据酶蛋白分子的大小和所带电荷量的不同，通过电泳使之分离，并利用酶的催化活性作用于底物，用不同方法显现出酶蛋白的特征性电泳谱带(酶谱)后进行判型(官大威，法医学辞典：化学工业出版社，2009年)。对于木聚糖酶，酶谱技术主要有两大用途，一是鉴定样品中是否存在有活性的木聚糖酶，蛋白条带处于什么位置；二是，样品中是否存在木聚糖酶的同工酶。目前用于木聚糖酶鉴定的酶谱法，多采用Native-Page与刚果红染色相结合的方法(Ninave等，PurificationandsharacterizationofextracellularxylanasefromStreptomycescyaneusSN32，BioresourceTechnology，2008，99：1252-1258)，但这种方法存在不易着色，操作繁琐，且需要额外一条Page胶与酶谱胶相对应以确定目的条带，由于不是同一块胶，两块胶间存在有偏差的风险。因此，寻找一种简单易操作的木聚糖酶酶谱鉴定方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，采用酶谱法，操作及着色简单，且采用同一块胶就能够鉴定出木聚糖酶蛋白条带及活性。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液电泳样品；步骤(2)制备分离胶层，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；步骤(3)将步骤(2)制备的胶放在垂直电泳槽中并加满Tris-甘氨酸缓冲液，再在浓缩胶层的样品槽中点样后，对所述垂直电泳槽施加电压，跑胶，直至木聚糖酶液样品中的溴酚蓝条带跑至垂直电泳槽的底层为止；步骤(4)利用割胶板将木聚糖酶液样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶层，保留分离胶层，即获得包含样品的条状分离胶；将所述包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；步骤(5)将孵育后的所述包含样品的条状分离胶紧密贴在培养皿的底物胶的胶面上，将培养皿放置在30-50℃的生化培养箱中，培养1-36小时，直至有清晰的条带和透明圈出现；所述底物胶由雷马素亮蓝R交联木聚糖、琼脂粉及pH2.0-8.0的乙酸钠缓冲液制成。本专利技术的有益效果：本专利技术中提供的鉴定方法，通过采用雷马素亮蓝R交联木聚糖为主要原料制备的底物胶与包含样品的条状分离胶在培养箱中的培养能够同一时间内鉴定出木聚糖酶及活性在同一块胶中的位置，步骤简单易操作。优选地，步骤(5)中所述底物胶的制备步骤：配置底物胶：称取10-100毫克雷马素亮蓝R交联木聚糖，0.15-0.6克琼脂粉，放入pH为2.0-8.0的乙酸钠缓冲液中，电炉上加热溶解，冷却至30-50℃，倒入培养皿中放置于桌面上，直至冷却凝固，即获得底物胶。所述底物胶的厚度优选为2-8毫米。优选地，步骤(1)中所述木聚糖酶液电泳样品包括木聚糖酶液与上样缓冲液。所述上样缓冲液包括0.5MTris-Hcl缓冲液、甘油、0.5％溴酚蓝及蒸馏水。优选地，所述上样缓冲液的制备：将1.25毫升0.5MTris-Hcl缓冲液，3毫升甘油，2毫升0.5％溴酚蓝，5.5毫升蒸馏水，混合均匀，即可获得上样缓冲液。优选地，所述木聚糖酶液的浓度为30-150微克/毫升，所述木聚糖酶液与上样缓冲液按体积比为1：1-2：1混合。优选地，步骤(2)中的分离胶由蒸馏水、30％丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl缓冲液、10％过硫酸铵、四乙基乙二胺制成；所述蒸馏水、30％丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl缓冲液、10％过硫酸铵、四乙基乙二胺原液的体积比为(1.60-1.70)：(1.8-2.1)：(1.2-1.4)：(0.02-0.07)：(0.003-0.005)。优选地，步骤(2)中的浓缩胶由蒸馏水、30％丙烯酰胺、0.5MTris-Hcl缓冲液、10％过硫酸铵、四乙基乙二胺制成；所述蒸馏水、30％丙烯酰胺、0.5MTris-Hcl缓冲液、10％过硫酸铵、四乙基乙二胺原液的体积比为(2.0-2.2)：(0.4-0.7)：(0.35-0.4)：(0.02-0.04)：(0.002-0.004)。优选地，步骤(3)中的跑胶步骤为：将步骤(1)中制备的木聚糖酶液样品，加入到样品槽中，调节电压为80v，开始跑胶，二十分钟后，将电压调为120v。优选地，步骤(4)中所述孵育时间为20-50分钟。优选地，步骤(5)中所述培养箱的温度为30-50℃，所述培养时间为1-36h。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术采用底物胶及分离胶，在同一块胶，能够同时鉴定出木聚糖酶蛋白条带及活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术实施例3在生化培养箱中培养12h鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的附图；图2附图为本专利技术实施例3在生化培养箱中培养24h鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的附图；图3附图为本专利技术实施例3在生化培养箱中培养36h鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的附图；图4附图为本专利技术实施例3在生化培养箱中培养48h鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的附图；图5附图为本专利技术对比例1鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的附图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述实施例中所采用的原料：溴酚蓝、甘油、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四乙基乙二胺、过硫酸铵、甘氨酸、考马斯亮蓝R-250、冰乙酸、乙醇均购自普通试剂公司；普通木聚糖、雷马素亮蓝R交联木聚糖(RemazolBrilliantBlueR-D-Xylan)购自Sigma-Ald本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液样品；步骤(2)制备分离胶层，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；步骤(3)将步骤(2)制备的胶放在垂直电泳槽中并加满Tris‑甘氨酸缓冲液，再在浓缩胶层的样品槽中点样后，对所述垂直电泳槽施加电压，跑胶，直至木聚糖酶液样品中的溴酚蓝条带跑至垂直电泳槽的底层为止；步骤(4)利用割胶板将木聚糖酶液样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶层，保留分离胶层，即获得包含样品的条状分离胶；将所述包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；步骤(5)将步骤(4)中孵育后的所述包含样品的条状分离胶紧密贴在培养皿的底物胶的胶面上，将培养皿放置在30‑50℃的生化培养箱中，培养1‑36小时，直至有清晰的条带和透明圈出现；所述底物胶由雷马素亮蓝R交联木聚糖、琼脂粉及pH 2.0‑8.0的乙酸钠缓冲液制成。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液样品；步骤(2)制备分离胶层，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；步骤(3)将步骤(2)制备的胶放在垂直电泳槽中并加满Tris-甘氨酸缓冲液，再在浓缩胶层的样品槽中点样后，对所述垂直电泳槽施加电压，跑胶，直至木聚糖酶液样品中的溴酚蓝条带跑至垂直电泳槽的底层为止；步骤(4)利用割胶板将木聚糖酶液样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶层，保留分离胶层，即获得包含样品的条状分离胶；将所述包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；步骤(5)将步骤(4)中孵育后的所述包含样品的条状分离胶紧密贴在培养皿的底物胶的胶面上，将培养皿放置在30-50℃的生化培养箱中，培养1-36小时，直至有清晰的条带和透明圈出现；所述底物胶由雷马素亮蓝R交联木聚糖、琼脂粉及pH2.0-8.0的乙酸钠缓冲液制成。2.根据权利要求1所述的一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，步骤(5)中所述底物胶的制备步骤：称取10-100毫克雷马素亮蓝R交联木聚糖，0.15-0.6克琼脂粉，放入30-50毫升pH为2.0-8.0的乙酸钠缓冲液中，电炉上加热溶解，冷却至30-50℃，倒入培养皿中，放置于桌面上，直至冷却凝固，即获得底物胶。3.根据权利要求1所述的一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，步骤(1)中所述木聚糖酶液样品包括木聚糖酶与上样缓冲液，所述上样缓冲液包括0.5MTris-Hcl缓冲液、甘油、0.5％溴酚蓝及蒸馏水。4.根据权利要求3所述的一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，所述上样缓冲液的制备：将1.25毫升0.5MTris-Hcl缓冲液，3毫升甘油，2毫升0.5％溴酚蓝，5.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵向辉，刘婵娟，瞿明仁，黎力之，潘珂，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36