扎那米韦-磁纳米粒子缀合物、其制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种扎那米韦‑磁纳米粒子缀合物、其制备方法及其在对流感病毒、该病毒的NA蛋白和RNA进行检测方面的用途。本发明专利技术的扎那米韦‑磁纳米粒子缀合物能够对浓度较低且成分复杂的样品中几乎全部类型的流感病毒和/或NA蛋白进行富集、分离和/或纯化，使得对流感病毒、该病毒的NA蛋白或RNA的提取和/或检测更加简便快捷。

【技术实现步骤摘要】
扎那米韦-磁纳米粒子缀合物、其制备方法及用途
本专利技术涉及生物材料领域，具体涉及扎那米韦-磁纳米粒子缀合物及其制备方法，以及该缀合物在对流感病毒、流感病毒的NA蛋白或RNA进行检测方面的用途。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，其宿主涉及人、猪、鸟、马和海豚等动物。流感病毒变异快、传播性高、危害性大。除造成季节性流感外，流感病毒的每次大规模流行都给人类社会造成重大损失。例如，1918年西班牙流感导致近2000万人死亡，1957年亚洲流感和1968年香港流感分别导致200万和150万人死亡。近年来，由于病毒的新变异毒株及耐药性的出现、人畜间跨种传播、全球人口流动性增强等原因，流感的大规模爆发呈上升趋势。2009年甲型H1N1病毒的全球性爆发和高致病性禽流感H5N1病毒的散在性爆发、2013年我国爆发的人感染禽H7N9新型流感病毒均造成巨大损失。因此，仍存在对流感病毒防控研究的迫切需求。在这方面，如果能在第一时间鉴定和明确流感病毒及种类，并提供病毒来源和相关特征，将有助于快速评估病毒的传播风险和健康危害，并为疫情的及时有效控制提供支持。然而，到目前为止，标准化最为完善的流感病毒分离鉴定方法涉及利用细胞、鸡胚或实验动物扩增病毒，并进行一系列的分离鉴定。整个过程至少需要两周，耗时耗力。最近10年发展的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是目前最为常用的检测流感病毒遗传物质的分子生物学技术。该方法的关键步骤在于提取并纯化流感病毒的RNA。然而，由于临床样品中病毒浓度较低且存在大量的抑制PCR反应的物质，需要除去这些抑制物并浓缩病毒RNA才可能得到可靠的检测结果。虽然市面上存在各种RNA提取试剂盒，然而，这些试剂盒大都存在操作繁琐、条件苛刻、耗时长、依赖离心机等大型设备的缺陷。另一方面，酶联免疫吸附(ELISA)是目前检测流感病毒特异性蛋白的最为常用的方法。然而，该方法的反应灵敏度和结果稳定性极大依赖于反应温度和pH，检测灵敏度较低。此外，实际的待测样品远比实验室样品复杂。在干扰物质多且流感病毒含量极低的情况下，ELISA方法的检测能力大为降低。事实上，在对病毒含量极低的复杂样品进行检测时，对流感病毒或其RNA、蛋白的富集分离极为重要。在这方面，磁纳米粒子因具有如下优点而被广泛用于富集分离：(1)比表面积较高，容易结合更多的靶标；(2)粒径均一，单分散；(3)具有超顺磁性，操作方便，省时省力。在利用磁纳米粒子实施富集分离步骤的检测方法中，常在磁纳米粒子表面修饰抗体，该抗体针对分布于流感病毒表面囊膜上的蛋白(例如针对血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2)，因此能够通过抗原-抗体特异性相互作用实现流感病毒的抓取和富集，以便于后续的分离纯化。然而，由于抗体价格昂贵且容易变性，制备的抗体-磁纳米粒子成本高昂且不易保存，即便回收也难以重复利用。另一方面，由于抗体的特异性过强，即便同一亚型流感病毒的不同毒株也需要单独实施富集分离。而对于未知亚型的新型突变株，由于针对性抗体的制备周期长，上述方法的适用性存在很大局限性。本领域仍存在探索新的流感病毒磁分离技术的需求。
技术实现思路
针对本领域的上述需求，在第一方面，本专利技术提供了一种扎那米韦-磁纳米粒子缀合物，该缀合物具有式X-1的结构：其中，所述Fe3O4@COOH表示磁纳米粒子部分，所述Fe3O4@COOH为由在外表面上具有羧基的聚合物包裹的Fe3O4磁纳米粒子；所述Ac为乙酰基；所述m为0-12的整数；所述n为0-11的整数；所述p为1-800,000的整数。在第二方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物。在第三方面，本专利技术提供了制备第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的方法，所述方法包含如下步骤：(1)制备Fe3O4@COOH，其中，所述Fe3O4@COOH为由在外表面上具有羧基聚合物包裹的Fe3O4磁纳米粒子；(2)将式X-3所示的化合物连接到步骤(1)获得的Fe3O4@COOH的表面，得到表面带有叠氮基团的磁纳米粒子；以及(3)将式X-2所示的化合物连接到步骤(2)得到的表面带有叠氮基团的磁纳米粒子的表面，得到所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物；N3CH2(CH2OCH2)nCH2NH2式X-3；其中，在所述式X-2和式X-3中，所述Ac为乙酰基；所述m为0-12的整数；所述n为0-11的整数。在第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或第二方面所述的试剂盒在对样品中的流感病毒、流感病毒的NA蛋白或流感病毒的RNA进行富集或检测方面的用途。在第五方面，本专利技术提供了一种对样品中的流感病毒或流感病毒的NA蛋白进行富集的方法，所述方法包括：(i)将第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或第二方面所述的试剂盒中的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物与样品进行孵育；以及(ii)磁分离并收集包含所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的部分，由此实现对所述样品中的流感病毒或流感病毒的NA蛋白的富集。在第六方面，本专利技术提供了一种对样品中的流感病毒进行检测的方法，所述方法包括：(a)将第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或第二方面所述的试剂盒中的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物与样品进行孵育；(b)磁分离并收集包含所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的部分；以及(c)对步骤(b)的所述部分进行测量，以对所述样品中的流感病毒进行检测。在第七方面，本专利技术提供了使用第一方面所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或第二方面所述的试剂盒在对流感患者进行诊断的方法，所述方法包括：从有需要的患者获取样品；将所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或所述试剂盒中的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物与所述样品孵育；磁分离并收集包含所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的部分；对所述部分进行测量，以此得出诊断结果。有益效果研究表明，神经氨酸酶(NA)以同源四聚体形式存在于流感病毒表面，具有糖苷外切酶活性，可水解宿主细胞表面的唾液酸残基与邻近寡糖间的α糖苷键。在流感病毒的生活周期中，NA发挥重要作用。NA通过水解宿主呼吸道粘膜蛋白表面的唾液酸残基，降低黏液的黏度，促进流感病毒穿过黏液并侵染呼吸道上皮细胞；当子代病毒从宿主细胞中释放时，NA通过水解切除与病毒HA结合的宿主细胞表面的唾液酸残基，防止新生病毒聚集成团簇。根据血清型检测结果可将流感病毒的NA划分为11个亚型。扎那米韦(Zanamivir，商品名Relenza、瑞乐沙)是第一个被美国FDA批准上市的神经氨酸酶抑制剂，其与NA结合的Ki为0.03nM，表明扎那米韦对NA具有较强的结合能力。此外，扎那米韦对各亚型的NA均有较强的结合能力。已报道扎那米韦的7位羟基与NA活性位点周围的氨基酸无相互作用，且朝向结合口袋的外部，是理想的连接位点。鉴于此，本专利技术的专利技术人利用化学合成的方法，将扎那米韦成功地缀合至包被有羧基化合物的磁纳米粒子的表面，制备出扎那米韦-磁纳米粒子缀合物。本专利技术的制备扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的方法首次实现了以不带有保护基团的扎那米韦衍生物直接作为原料，将其连接至磁纳米粒子骨架。这种不利用保护基团对扎那米韦的胍基进行保护的直接对接方法简化了制备步骤，首次实现了扎那米韦功能域的模块化合成，使得作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扎那米韦‑磁纳米粒子缀合物，该缀合物具有式X‑1的结构：

【技术特征摘要】
1.一种扎那米韦-磁纳米粒子缀合物，该缀合物具有式X-1的结构：其中，所述Fe3O4@COOH表示磁纳米粒子部分，所述Fe3O4@COOH为由在外表面上具有羧基的聚合物包裹的Fe3O4磁纳米粒子；所述Ac为乙酰基；所述m为0-12的整数；所述n为0-11的整数；所述p为1-800,000的整数。2.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物。3.制备权利要求1所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物的方法，所述方法包含如下步骤：(1)制备Fe3O4@COOH，其中，所述Fe3O4@COOH为由在外表面上具有羧基聚合物包裹的Fe3O4磁纳米粒子；(2)将式X-3所示的化合物连接到步骤(1)获得的Fe3O4@COOH的表面，得到表面带有叠氮基团的磁纳米粒子；以及(3)将式X-2所示的化合物连接到步骤(2)得到的表面带有叠氮基团的磁纳米粒子的表面，得到所述扎那米韦-磁纳米粒子缀合物；N3CH2(CH2OCH2)nCH2NH2式X-3；其中，在所述式X-2和式X-3中，所述Ac为乙酰基；所述m为0-12的整数；所述n为0-11的整数。4.权利要求1所述的扎那米韦-磁纳米粒子缀合物或权利要求2所述的试剂盒在对...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，张振兴，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11