一种烟曲霉素的提取纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种烟曲霉素的提取纯化方法，包括甲基叔丁基醚(MTBE)或乙基叔丁基醚(ETBE)发酵液萃取、MTBE或ETBE沉淀和结晶纯化等步骤。该方法操作简单、收率高、成本低廉、可大规模工业化生产，对烟曲霉素的产业化生产及后续烟曲霉素衍生物的开发具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种烟曲霉素的提取纯化方法
本专利技术涉及制药领域。具体的说，本专利技术涉及一种烟曲霉素的提取纯化方法。
技术介绍
烟曲霉素(Fumagillin，式I)是从烟曲霉(AspergillusFumigatus)的发酵培养液中首次分离得到的具有多种生物活性的代谢产物。最初，烟曲霉素被用来杀死蜜蜂的微孢子虫寄生虫，后来发现可以用于治疗人肠道感染引起的微孢子虫病和(或)隐孢子虫病，而这种疾病对于免疫缺陷患者是相当致命的。另外，烟曲霉素几乎不溶于水，而且光照易降解，极大地影响了其生物利用，而研究人员发现烟曲霉醇等衍生物性质稳定，且效果好于烟曲霉素，而烟曲霉醇等相关衍生物是以烟曲霉素为原料制备而成。因此，如何大规模工业化生产纯度较高的烟曲霉素，对烟曲霉素及其衍生物产品的研究具有重大意义。通过文献调研，目前，制备烟曲霉素的方法主要是通过发酵培养烟曲霉Aspergillusfumigatus，然后经过提取纯化得到烟曲霉素(EbleandHanson,1951；McCowenetal.,1951)。公开的提取方法主要针对烟曲霉(产物主要在菌体的胞外，胞内也有一定的单位)的发酵产物获得，其提取方法都是先通过过滤去除菌体滤渣并获得滤液，然后对滤液进行进一步纯化获得烟曲霉素。US2898268公开了发酵培养物经过过滤后得到滤液，滤液通过加入supercel助滤剂并调酸获得沉淀，沉淀用丙酮提取并浓缩至一定体积后再沉淀，然后将丙酮沉淀物用氯仿进行提取并浓缩至半固体状态，再溶解在甲醇中，将溶解液转入零下四十摄氏度中冷却过夜，收集粗的晶体，最后，将粗晶型溶解在热甲醇中，过滤并冷藏结晶，过滤并在真空下干燥，获得晶体。上述操作复杂且收率极低，仅为15.5％，不利于进行烟曲霉素的大规模工业化生产。CN201610104785.6公开了一种使用大孔吸附树脂从烟曲霉的发酵液中提取纯化烟曲霉素的方法，该方法通过大孔吸附树脂及纯化，然后经过冷冻干燥获得针状晶体。其中一步树脂层析能够获得81.2％色谱纯度的晶体，需要二步树脂层析才能够获得95.2％色谱纯度晶体，操作步骤复杂；同时，烟曲霉素的水溶性非常差、对光和热极不稳定，层析周期长，易产生较多杂质；大孔吸附树脂需采用含水的溶剂洗脱，且需要较多的洗脱液，成本较高；综上可知上述方法不利于烟曲霉素的大规模工业化生产。此外，上述所有工艺都是针对胞外烟曲霉素的提取工艺，没有考虑胞内烟曲霉素的提取情况。综上，现有工艺都不能很好的满足烟曲霉素的大规模工业化生产的需求。因此，寻找一种操作简便、周期短、成本低、收率高、可大规模工业化生产的烟曲霉素的制备方法非常迫切。
技术实现思路
本专利技术保护了一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:步骤a):烟曲霉素发酵液经MTBE(甲基叔丁基醚)或ETBE(乙基叔丁基醚)搅拌、静置、分液，得到MTBE或ETBE萃取相；步骤b):将步骤a)得到的MTBE或ETBE萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C1-C2醇，结晶8-12h过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C1-C2醇的体积为滤液①体积的3～10倍；步骤d):将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用有机溶剂②溶解、过滤得滤液②，滤液②在减压下搅拌，同时向滤液②中加入C1-C2醇，结晶8-12h后过滤、干燥得到烟曲霉素成品；优选地，所加入C1-C2醇的体积为滤液②体积的3～10倍；所述步骤c)中有机溶剂①或步骤d)中有机溶剂②为氯代烃或氯代烃与C1-C2醇的混合溶剂，所述氯代烃为二氯甲烷或三氯甲烷，所述C1-C2醇为甲醇或乙醇；所述步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)均在避光下进行。在优选的实施方案中，所述步骤a)中MTBE或ETBE与烟曲霉素发酵液的体积比为1.5：1～3：1。在优选的实施方案中，所述步骤a)中静置的时间为5～10h。在优选的实施方案中，所述步骤a)中搅拌的时间为1～5h。在优选的实施方案中，所述步骤b)中搅拌的时间8～12h。在优选的实施方案中，所述步骤b)中降温是指温度降到0～15℃。在优选的实施方案中，本专利技术所述步骤b)中浓缩的温度控制在40℃以下。在优选的实施方案中，所述步骤c)中烟曲霉素湿固体与有机溶剂①的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)；所述步骤d)中烟曲霉素粗品与有机溶剂②的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)。在优选的实施方案中，所述步骤c)中加入C1-C2醇的方式为滤液①减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液①体积的C1-C2醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液①体积的C1-C2醇；所述步骤d)中加入C1-C2醇的方式为滤液②减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液②体积的C1-C2醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液②体积的C1-C2醇。在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中氯代烃与C1-C2醇的混合溶剂中C1-C2醇的体积不超过氯代烃的体积。在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中减压时压力为-0.08～-0.1MPa。在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中结晶的温度为-10～8℃。在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中搅拌的速率为100～250r/min。在优选的实施方案中，本专利技术所述步骤d)中干燥为真空干燥。在优选的实施方案中，所述步骤d)中真空干燥的压力为-0.08～-0.1MPa，干燥的时间为20～40h，干燥的温度为10～30℃。在优选的实施方案中，所述烟曲霉素发酵液是烟曲霉素产生菌经过有氧发酵制得的，所述烟曲霉素产生菌优选青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCCNo.14144。本专利技术所述的青霉HS-NF-684Z的微生物菌种于2017年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.14144，分类名为青霉(Penicilliumsp.)，并登记在册，证明存活。应当强调的是，本专利技术技术方案中所涉及的数值或数值端点，其含义或意义的保护范围并不局限于该数字本身，本领域技术人员能够理解，它们包含了那些已被本领域广为接受的可允许误差范围，例如实验误差、测量误差、统计误差和随机误差等等，而这些误差范围均包含在本专利技术的范围之内。本专利技术相对于现有技术，提供了一种新的可大规模工业化生产烟曲霉素原料的技术方案，其针对胞内和胞外的烟曲霉素都能得到很好的分离和纯化。本专利技术通过MTBE或ETBE发酵液萃取、MTBE或ETBE沉淀、结晶纯化可以得到含量在96.5％以上的烟曲霉素产品，且总收率在55％以上；该工艺操作简单、收率高、成本低、制得的烟曲霉素纯度高、可大规模化工业生产，对烟曲霉素及其它衍生物产品的研究具有重大意义。本专利技术较现有技术的有益效果在于：①与现有技术制备烟曲霉素的收率仅为15％相比，本专利技术制备烟曲霉素的收率在55％以上，且制得的烟曲霉素的含量也较高，为96.5％以上，可大规模工业化生产。②本专利技术所使用的菌株为一种新的烟曲霉素生产菌，该菌为青霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:步骤a):烟曲霉素发酵液经甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚搅拌、静置、分液，得到甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相；步骤b):将步骤a)得到的甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C1‑C2醇，结晶8‑12h，过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C1‑C2醇的体积为滤液①体积的3～10倍；步骤d):将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用有机溶剂②溶解、过滤得滤液②，滤液②在减压下搅拌，同时向滤液②中加入C1‑C2醇，结晶8‑12h后过滤、干燥得到烟曲霉素成品；优选地，所加入C1‑C2醇的体积为滤液②体积的3～10倍；所述步骤c)中有机溶剂①或步骤d)中有机溶剂②为氯代烃或氯代烃与C1‑C2醇的混合溶剂，所述氯代烃为二氯甲烷或三氯甲烷，所述C1‑C2醇为甲醇或乙醇；所述步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)均在避光下进行。

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:步骤a):烟曲霉素发酵液经甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚搅拌、静置、分液，得到甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相；步骤b):将步骤a)得到的甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C1-C2醇，结晶8-12h，过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C1-C2醇的体积为滤液①体积的3～10倍；步骤d):将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用有机溶剂②溶解、过滤得滤液②，滤液②在减压下搅拌，同时向滤液②中加入C1-C2醇，结晶8-12h后过滤、干燥得到烟曲霉素成品；优选地，所加入C1-C2醇的体积为滤液②体积的3～10倍；所述步骤c)中有机溶剂①或步骤d)中有机溶剂②为氯代烃或氯代烃与C1-C2醇的混合溶剂，所述氯代烃为二氯甲烷或三氯甲烷，所述C1-C2醇为甲醇或乙醇；所述步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)均在避光下进行。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中MTBE或ETBE与烟曲霉素发酵液的体积比为1.5：1～3：1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中搅拌的时间为1～5h，所述步骤b)中搅拌的时间8～12h。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建宋，王继栋，张辉，姜南，张延青，钱娉婷，邓爱文，应灵萍，滕云，郑玲辉，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33