本发明专利技术公开一种分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻及复苏方法，即用L‑15完全培养基培养海洋尾丝虫到指数生长期、指数期至成虫，再用L‑15完全培养基重悬其密度为20万个/mL，吸取海洋尾丝虫成虫液加入到冻存管中，添加体积比为40%的灭菌甘油，10%的二甲亚砜，混匀，将冻存管快速放入程序化梯度降温细胞冻存盒中，于‑80℃过夜，然后放入液氮中，即可长期保存。从液氮里取出冻存管快速放入水浴锅中，37℃水浴2 min，之后4000 rpm离心5 min，弃上清，加入L‑15完全培养基重悬，转入多孔板中，20℃恒温培养箱中培养三天，即可复苏。
【技术实现步骤摘要】
分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻保存及复苏方法
本专利技术属于生物
，涉及一种盾纤毛虫的保存及复苏方法，尤其是一种分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫（Uronemamarinum）的冷冻保存及复苏方法。
技术介绍
海洋尾丝虫（Uronemamarinum）隶属于盾纤目，纤毛虫类，是一种个体微小的兼性寄生纤毛虫。海洋尾丝虫适应性极强，可自由生活于各种养殖水体中。一旦养殖水体中残饵过多、环境恶化等导致有机物含量过高，海洋尾丝虫就会大量繁殖，寄生于各养殖期鱼体，尤其是体表损伤的鱼体，以宿主的细胞或组织碎片为食，严重时继发细菌性疾病，导致养殖鱼类大量死亡。已报道的海洋尾丝虫可引起大菱鲆、牙鲆、红鳍东方鲀以及其他海水养殖鱼类发病，死亡率较高。目前，国内外已经有多位学者对盾纤毛虫进行研究并报道了其对海水养殖鱼类造成的严重危害。然而现有用于研究的盾纤毛虫主要是通过体外连续传代培养保种，存在着体外培养传代繁琐、传代失败导致虫株丢失、细菌污染、虫蛀感染能力减弱、种质突变及免疫原性丧失等问题。目前盾纤毛虫的冷冻保存及复苏还是空白，特别是没有关于海洋尾丝虫冷冻保存的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种分离于红鳍东方鲀海洋尾丝虫的冷冻保存及复苏方法。本专利技术的技术解决方案是：一种分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻保存方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.分离得到寄生于红鳍东方鲀体表的海洋尾丝虫（Uronemamarinum），接种于肉汤培养基中体外驯化培养15天，得海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100mL灭菌海水加5g红鳍东方鲀鱼肉匀浆煮沸10min，再经200目的纱布过滤后所得；b.再将海洋尾丝虫液按体积比为1：100接种于肉汤培养基中，20℃培养120hr，获得处于指数生长期的海洋尾丝虫液；c.吸取1mL处于指数生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5mL离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中加入1mLL-15完全培养基，静置5min，吸取上清液于另一离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，再用1mLL-15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫悬液；所述L-15完全培养基为在L-15培养基中添加总质量百分比为1%的青链霉素及总质量百分比为10%的胎牛血清，用氯化钠调节盐度为35‰，调节pH为7.2；d.用L-15完全培养基连续稀释海洋尾丝虫悬液，在显微镜下吸取形态完整且活力较强的单个海洋尾丝虫，加入到含有200µL的L-15完全培养基的多孔板中，20℃恒温培养96hr，得到纯化的海洋尾丝虫液；e.用L-15完全培养基稀释纯化的海洋尾丝虫液至1000个/mL并吸取100µL接种于50mL锥形瓶中，加入20mL的L-15完全培养基，封口膜密封，20℃恒温培养120hr，得到指数期的海洋尾丝虫液；f.将指数期的海洋尾丝虫液转移到离心管中，2000rpm离心10min，弃上清液，加入L-15完全培养基，20℃静置5min，吸取上清液，加入到另一离心管中，调节海洋尾丝虫种群密度为20万个/mL，得海洋尾丝虫成虫液；g.吸取f步骤所得海洋尾丝虫成虫液加入到冻存管中并添加灭菌甘油及二甲亚砜混匀，所述海洋尾丝虫成虫液、灭菌甘油及二甲亚砜的体积比为5:4:1；h.将冻存管放入程序化梯度降温细胞冻存盒中，于-80℃过夜，然后放入液氮中保存。一种与上述分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻保存方法对应的复苏方法，其特征在于：将保存于液氮中的冻存管放入水浴锅中，37℃水浴2min，4000rpm离心5min，弃上清，加入L-15完全培养基重悬，转入多孔板中，20℃恒温培养箱中，培养三天，即可复苏。本专利技术避免了海洋尾丝虫体外连续传代的繁琐过程，同时也避免了传代过程中细菌污染，能够保存原有虫株，防止虫株遗传漂变以及因虫株连续传代导致的虫株毒力减弱等优点。附图说明图1是本专利技术实施例2虫体复苏天数与数量示意图。图2是本专利技术实施例虫体冷冻前与复苏后的形态对比图。具体实施方式实施例1：a.从辽宁省大连市某养殖场患病红鳍东方鲀体表溃烂组织处分离出盾纤毛虫，鉴定为海洋尾丝虫（Uronemamarinum），将所得到的海洋尾丝虫接种于肉汤培养基中体外驯化培养15天，得海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100mL灭菌海水加5g红鳍东方鲀鱼肉匀浆煮沸10min，再经200目的纱布过滤后所得；b.再将海洋尾丝虫液按体积比为1：100接种于肉汤培养基中，20℃培养120hr，获得处于指数生长期的海洋尾丝虫液；c.吸取1mL处于指数生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5mL离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中缓慢加入1mLL-15完全培养基，静置5min，吸取上清液于另一离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，再用1mLL-15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫悬液；所述L-15完全培养基为在L-15培养基中添加有青链霉素和胎牛血清，盐度为35‰，pH为7.2，所述L-15培养基、青链霉素及胎牛血清的质量比为1：0.01：0.1；d.用L-15完全培养基连续稀释海洋尾丝虫悬液，在显微镜下吸取形态完整且活力较强的单个海洋尾丝虫，加入到含有200µL的L-15完全培养基的多孔板中，20℃恒温培养96hr，得到纯化的海洋尾丝虫液；e.用L-15完全培养基稀释纯化的海洋尾丝虫液至1000个/mL并吸取100µL接种于50mL锥形瓶中，加入20mL的L-15完全培养基，封口膜密封，20℃恒温培养120hr，得到指数期的海洋尾丝虫液；f.将指数期的海洋尾丝虫液转移到离心管中，2000rpm离心10min，弃上清液，缓慢加入L-15完全培养基，20℃静置5min，吸取含有盾纤毛虫的上清液，加入到另一离心管中，用浮游生物计数框计数种群密度，调节海洋尾丝虫种群密度为20万个/mL，得海洋尾丝虫成虫液；g.吸取f步骤所得海洋尾丝虫成虫液加入到冻存管中并添加灭菌甘油及二甲亚砜混匀，所述海洋尾丝虫成虫液、灭菌甘油及二甲亚砜的体积比为5:4:1；h.将冻存管快速放入程序化梯度降温细胞冻存盒中，于-80℃过夜，然后放入液氮中保存。实施例2：本专利技术与实施例1对应的复苏方法如下：将保存于液氮中24小时的冻存管快速放入水浴锅中，37℃水浴2min，4000rpm离心5min，弃上清，加入L-15完全培养基重悬，转入多孔板中，20℃恒温培养箱中，培养七天。每天显微镜下观察并计数（数值表示为平均值±标准误），结果：第一天至第二天，处于停滞期，未观察到活力较强虫体；第三天，观察到活动旺盛虫体，计数其种群密度为1586±82个/mL；第四天，计数其种群密度为158400±1728个/mL；第五天，计数其种群密度为590000±20406个/ml；第六天，计数其种群密度为460133±27280个/mL；第七天，计数其种群密度为423066±6130个/ml。具体结果如图1所示，说明虫体培养三天即可复苏。本专利技术实施例虫体冷冻前与复苏后的形态对比如图2所示。图2中，A是实施例1冷冻保存前的海洋尾丝虫的形态图片（甲醛固定，1000倍视野）；B是实施例1冷冻保存前的海洋尾丝虫的形态图片（甲基绿派洛宁染色，1000倍视野）；C是实施例2复苏本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻保存方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 分离得到寄生于红鳍东方鲀体表的海洋尾丝虫（Uronema marinum），接种于肉汤培养基中体外驯化培养15天，得海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100 mL灭菌海水加5g红鳍东方鲀鱼肉匀浆煮沸10 min，再经200目的纱布过滤后所得；b. 再将海洋尾丝虫液按体积比为1：100接种于肉汤培养基中，20 ℃培养120 hr，获得处于指数生长期的海洋尾丝虫液；c. 吸取1 mL处于指数生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5mL离心管中，2000 rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中加入1 mL L‑15完全培养基，静置5 min，吸取上清液于另一离心管中，2000 rpm离心10分钟，弃上清液，再用1 mL L‑15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫悬液；所述L‑15完全培养基为在L‑15培养基中添加总质量百分比为1%的青链霉素及总质量百分比为10%的胎牛血清，用氯化钠调节盐度为35‰，调节pH为7.2；d. 用L‑15完全培养基连续稀释海洋尾丝虫悬液，在显微镜下吸取形态完整且活力较强的单个海洋尾丝虫，加入到含有200 µL的L‑15完全培养基的多孔板中，20 ℃恒温培养96 hr，得到纯化的海洋尾丝虫液；e. 用L‑15完全培养基稀释纯化的海洋尾丝虫液至1000个/mL并吸取100 µL接种于50 mL锥形瓶中，加入20 mL的L‑15完全培养基，封口膜密封，20 ℃恒温培养120 hr，得到指数期的海洋尾丝虫液；f. 将指数期的海洋尾丝虫液转移到离心管中，2000 rpm离心10 min，弃上清液，加入L‑15完全培养基，20℃静置5 min，吸取上清液，加入到另一离心管中，调节海洋尾丝虫种群密度为20万个/mL，得海洋尾丝虫成虫液；g. 吸取f步骤所得海洋尾丝虫成虫液加入到冻存管中并添加灭菌甘油及二甲亚砜混匀，所述海洋尾丝虫成虫液、灭菌甘油及二甲亚砜的体积比为5:4:1；h. 将冻存管放入程序化梯度降温细胞冻存盒中，于‑80 ℃过夜，然后放入液氮中保存。...
【技术特征摘要】
1.一种分离于红鳍东方鲀的海洋尾丝虫的冷冻保存方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.分离得到寄生于红鳍东方鲀体表的海洋尾丝虫（Uronemamarinum），接种于肉汤培养基中体外驯化培养15天，得海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100mL灭菌海水加5g红鳍东方鲀鱼肉匀浆煮沸10min，再经200目的纱布过滤后所得；b.再将海洋尾丝虫液按体积比为1：100接种于肉汤培养基中，20℃培养120hr，获得处于指数生长期的海洋尾丝虫液；c.吸取1mL处于指数生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5mL离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中加入1mLL-15完全培养基，静置5min，吸取上清液于另一离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，再用1mLL-15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫悬液；所述L-15完全培养基为在L-15培养基中添加总质量百分比为1%的青链霉素及总质量百分比为10%的胎牛血清，用氯化钠调节盐度为35‰，调节pH为7.2；d.用L-15完全培养基连续稀释海洋尾丝虫悬液，在显微镜下吸取形态完整且活力较强的单个海洋尾丝虫，加入到含有200µL的...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎睿君，高延奇，叶仕根，王伟，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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