布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用制造技术

本发明专利技术公开了布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用，其中ncRNA1351回复株，命名为16M‑ncRNA1351，由ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351转化有序列表中SEQ ID NO：3所示的ncRNA1351回复载体ncRNA1351‑MCS。该ncRNA1351回复株可用于以ncRNA1351为靶点的抗布鲁氏菌药物筛选中。

【技术实现步骤摘要】
布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用本申请为申请日2016年2月26日、申请号201610108291.5、专利技术名称“布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其应用”的分案申请。
本专利技术涉及细菌非编码小RNA(smallnon-codingRNA，sRNA)，特别是涉及一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其功能与应用。
技术介绍
细菌非编码小RNA(smallnon-codingRNA，sRNA)是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50-400个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控。目前，非编码小RNA已成为生命科学研究的前沿和热点。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用。迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如：霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等。在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。布鲁氏菌是胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞(主要是巨噬细胞)内，胞内存活和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机理至关重要。由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，专利技术人推测出sRNA在布鲁氏菌的胞内生存和毒力调控中发挥一定的作用。因此，识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进行研究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理。已有研究人员对布鲁氏菌非编码小RNA进行了预测，包括BSR-2，BSR-16等，专利文献CN103710345A也公开了一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，提供用于检测其表达量的引物、探针，以及提供该RNA分子的回复菌株。本专利技术所述来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(smallnon-codingRNA，sRNA)，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。ncRNA1351回复载体属于本专利技术。回复载体命名为ncRNA1351-MCS，由序列表中SEQIDNO：3所示。布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株属于本专利技术，其命名为16M-ncRNA1351，是由序列表中SEQIDNO：3所示的回复载体ncRNA1351-MCS转化得到。具体的，将回复载体ncRNA1351-MCS质粒DNA电转化至ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351电感受态细胞，筛选双抗性克隆即为ncRNA1351回复菌株16M-ncRNA1351。所述ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351，是以布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M为出发菌株转化ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T(其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示)得到。非编码小RNA分子ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在抗布鲁氏菌药物筛选中的应用也属于本专利技术。用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物也属于本专利技术，该引物包括：ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和ncRNA1351-RT-R：GGCGGCGTTTTCGTTTC。检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351RNA表达的探针也属于本专利技术，该探针为地高辛标记探针，序列为：ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA。本专利技术用生物信息学的方法预测和分析出一个新的布鲁氏菌非编码小RNAncRNA1351。Northernblot实验证实了ncRNA1351在布鲁氏菌中的存在。通过构建ncRNA1351的布鲁氏菌缺失突变株和回复株对ncRNA1351的功能进行了分析，实验结果表明：ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，说明ncRNA1351与布鲁氏菌的毒力相关。因此，可以ncRNA1351为靶点制备抗布鲁氏菌药物，其长105nt，相较于已有研究的RNABSR0601的长度更短，更具有应用价值。本专利技术将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用，ncRNA1351回复株可用于在以ncRNA1351为靶点的抗布鲁氏菌药物筛选中。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为ncRNA1351在布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M不同生长时期表达情况的Northernblot检测结果；图2为ncRNA1351在酸、热、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况；图3A为ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T的物理图谱；图3B为ncRNA1351回复载体ncRNA1351-MCS的物理图谱；图4为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的RT-PCR鉴定结果；图5为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析结果；图6为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的小鼠毒力实验结果。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100mL)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本专利技术生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物，包括：ncRNA1351‑RT‑F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和ncRNA1351‑RT‑R：GGCGGCGTTTTCGTTTC；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，或与序列表中SEQ ID NO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2015.12.24 CN 201510991171X1.用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物，包括：ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和ncRNA1351-RT-R：GGCGGCGTTTTCGTTTC；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。2.检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351RNA表达的探针，为地高辛标记探针，序列为：ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。3.布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，命名为16M-ncRNA1351，其特征在于，在布鲁氏菌野生株16M中转化有ncRNA1351回复载体；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉飞，段萃娟，马雪平，郭晓今，孙涛，宋丽洁，张景，张甜甜，
申请(专利权)人：中国人民武装警察部队总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11