本发明专利技术公开了一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv‑Fc及其制备方法。该融合抗体scFv‑Fc至少具有如SEQ ID No:1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽以及如SEQ ID No:3所示氨基酸序列的Fc片段。ELISA结果显示,该融合抗体能和金黄色葡萄球菌抗原特异性结合;在体外抑菌试验中,该融合抗体在24h内能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长;且该融合抗体能介导奶牛外周血吞噬细胞发挥调理吞噬作用。该融合抗体在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中,具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法
本专利技术涉及一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法,属于基因工程
技术介绍
奶牛乳腺炎是指奶牛乳腺组织的炎症,它是影响奶牛业发展,给乳品生产带来巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的病原菌很多,其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎一方面主要采用抗生素治疗,但此治疗方法导致耐药菌株出现得越来越多,而且抗性奶对人类的健康也带来了一定的威胁;另一方面主要采用疫苗,目前有很多针对金黄色葡萄球菌活的或者灭活的菌体,分离的黏附素、毒素和多糖等毒力因子制作的疫苗出现,可能由于细菌抗原的变异使致病因子的结构发生了改变,这些疫苗的治疗效果均不理想。因为疫苗的作用机理是刺激机体产生抗体,所以抗体制剂也许能对其感染起到一定的预防和治疗的作用。单链抗体是一种基因工程抗体,通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成,是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。IgG分子的Fc片段包含有铰链区(Hinge),重链恒定区2(Heavychainconstantregion,CH2)和重链恒定区3(Heavychainconstantregion,CH3),铰链区和CH3区域可以维持IgG分子的稳定性,CH2区域在IgGFc片段发挥功能方面有着重要作用。融合抗体scFv-Fc既能与抗原结合,又具有Fc片段介导的吞噬细胞的调理吞噬作用,且可以进行原核和真核表达并大规模工程化制备,显示了巨大的应用潜力,越来越受到人们的重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc,该融合抗体能够与金黄色葡萄球菌特异性结合,具有一定的抑菌活性,且能介导外周血吞噬细胞发挥调理吞噬作用,能够用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的诊断、预防和/或治疗。一种抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的融合抗体scFv-Fc,其至少具有如SEQIDNo:1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQIDNo:2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽,以及如SEQIDNo:3所示氨基酸序列的Fc片段。上述中间连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS。上述融合抗体scFv-Fc具有如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。本专利技术的再一目的是提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的制备方法,包括以下步骤:(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因;(2)利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体基因;(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建重组质粒;(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌,培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库;(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原,富集淘选四轮;(6)采用phageELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原,筛选阳性克隆;(7)扩增牛IgGFc片段,所扩增的Fc片段包含Hinge、CH2和CH3区域;(8)将步骤(6)中筛选得到的阳性克隆scFv、Fc片段与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒转化Rosetta细胞后,进行诱导表达所得产物即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的融合抗体scFv-Fc。(按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行)需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料,所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本专利技术各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本专利技术所陈述的方法准确获得。本专利技术的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备介导外周血吞噬细胞对金黄色葡萄球菌吞噬作用药物中的应用。本专利技术的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。本专利技术的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。本专利技术的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体(scFv)基因,并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建牛源单链抗体初级文库,辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库;用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原经过四轮的富集淘选后,采用phageELISA方法筛选阳性克隆,将筛选得到的阳性克隆scFv、Fc片段与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒转化Rosetta细胞后,进行诱导表达所得产物即为牛源性抗金黄色葡萄球菌的融合抗体scFv-Fc。证明该融合抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性和具有Fc片段介导的吞噬细胞的调理吞噬功能。和现有技术相比,本专利技术的有益效果是:抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的融合抗体scFv-Fc能与金黄色葡萄球菌特异性结合,该融合抗体scFv-Fc具有一定的体外抑菌活性,其24小时内完全抑制金黄色葡萄球菌的生长,并具有Fc片段介导外周血吞噬细胞发挥的调理吞噬作用,能够用于奶牛乳腺炎的预防和治疗。附图说明图1:牛外周血淋巴细胞扩增VH,VL和scFv;泳道M,Marker2000;泳道1,VH;泳道2,VL;泳道3,scFv(VL-Linker-VH)。图2:牛外周血淋巴细胞扩增IgGFc(Hinge+CH2+CH3);泳道M,Marker2000;泳道N,阴性对照;泳道1-3,Fc片段。图3:牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的氨基酸序列。图4:牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的纯化;泳道M,蛋白Marker;泳道1,100mM咪唑洗脱蛋白;泳道2,150mM咪唑洗脱蛋白。图5:牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc体外抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923图6:牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的调理吞噬作用。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案进行详细介绍。实施例1牛源噬菌体单链抗体文库的构建1:采集患乳腺炎的奶牛血液,ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时,继续后续实验。将抗凝血提取外周核淋巴细胞,用Trizol法(TRIZOLReagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版,采用Oligoprimer,根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤,合成第1链cDNA。2:根据已发表文献的牛抗体编码基因可变区序列(MadhuriKotia,2010MolecularImmunology;2011,Vaccine)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1),其中VHF和VHR用于扩增VH区;VLF和VLR用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv‑Fc,其特征在于,其至少具有如SEQ ID No:1所示氨基酸序列的轻链可变区;如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的重链可变区;如SEQ ID No:3所示氨基酸序列的Fc片段。
【技术特征摘要】
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc,其特征在于,其至少具有如SEQIDNo:1所示氨基酸序列的轻链可变区;如SEQIDNo:2所示氨基酸序列的重链可变区;如SEQIDNo:3所示氨基酸序列的Fc片段。2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc,其特征在于:位于重链可变区和轻链可变区之间的中间连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS。3.根据权力要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc,其特征在于:所述的融合抗体具有如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。4.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因VH和轻链可变区VL基因;(2)利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体基因;(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体p...
【专利技术属性】
技术研发人员:朱建国,王曼,王婷婷,王凤青,张波,
申请(专利权)人:上海交通大学,
类型:发明
国别省市:上海,31
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