一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针及其应用制造技术

一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF‑ON型近红外荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP2J2的酶活性。CYP2J2酶活性测定的流程如下：选择半菁羟基烷基化衍生物去烷氧基反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其去烷氧基代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP2J2酶的活性。本发明专利技术可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CYP2J2酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP2J2活力定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP2J2处置药物能力的评估。还可用于体外快速筛选CYP2J2的抑制剂，并评估其抑制能力和肿瘤中CYP2J2活性的检测，并用以检测CYP2J2在肿瘤迁移侵袭中的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针反应及其应用。
技术介绍
细胞色素P450为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，是表达于内质网膜上的混合功能氧化酶系统末端氧化酶，在多种内源化合物如脂肪酸、维生素、胆固醇及甾体类的代谢激活以及外源物包括药物、致癌物、环境污染物等物质的体内代谢过程中均发挥中重要作用。CYP2J2主要表达于肝外组织，其在心肌细胞和主动脉周围的上皮细胞中表达量较高。人的CYP2J2首次发现于1996年，是目前人体中发现的CYP2J亚家族中的唯一成员。CYP2J2作为重要的心血管系统平衡状态调节酶，可代谢内源化合物花生四烯酸并催化其生成多种表氧化二十碳三烯酸异构体，从而影响心血管系统的生理及病理状态。CYP2J2还高度表达于人类肿瘤组织，参与癌细胞的增殖和转移，并在多种药物的代谢中发挥重要作用。因此，开发高选择性的CYP2J2的近红外荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针底物及其应用，该OFF-ON型近红外荧光探针底物没有荧光，脱烷氧基产物具有近红外荧光发射，能够减少背景荧光干扰。利用该探针反应可对多种生物体系中CYP2J2的分布和功能进行定量评价。本专利技术提供了一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针反应，该探针可被CYP2J2特异性催化生成相应的O-脱烷氧基产物，其结构通式如式(1)所示，半菁羟基烷基化结构类结构，其结构通式如下：其中，R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基等烷基链。R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基等。R3为H，F，Cl，Br。进一步的，R1为甲基、乙基；R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R3为H。本专利技术中(E)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐(半菁羟基烷基化)类化合物具有代谢产物单一(仅生成一个O-去烷氧基产物)、代谢酶高选择性(主要由CYP2J2代谢)、代谢产物易于检测，且灵敏度高等特点。本专利技术还提供了所述细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针反应的应用，采用上述式(1)化合物作为CYP2J2亚酶的特异性底物，进行O-脱烷氧基结合反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其O-脱烷氧基产物的生成率，来定量测定不同生物体系(包括重组表达CYP2J2单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系)中CYP2J2活性；具体测定方法为：——体系中以半菁羟基烷基化类化合物作为OFF-ON型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。——在PBS缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；——反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的O-脱烷氧基产物达到定量限，且底物转化率不超过20％时终止反应；——测定单位时间内底物减少量或O-脱烷氧基产物生成量作为CYP2J2活性的评价指标。本专利技术提供的细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针反应的应用，该探针底物没有荧光，其O-脱烷氧基产物具有近红外荧光属性，可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；O-脱烷氧基产物荧光检测条件分别为：激发波长656nm，最大发射波长为718nm。该特异性探针底物为OFF-ON型近红外荧光探针，其在CYP2J2活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP2J2、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYP2J2酶活力的定量测定；同时也可作为在体及动物整体CYP2J2的探针底物，评估代谢酶CYP2J2的个体及种属差异。该探针底物及O-脱烷氧基代谢产物的荧光检测方法，还可用于CYP2J2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。采用重组细胞色素氧化酶CYP2J2单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，重组单酶代谢反应，特异性抑制实验，以及酶反应动力学几方面的证据，证明半菁羟基烷基化类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶CYP2J2代谢，生成O-脱烷氧基产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。作为高特异性的细胞色素氧化酶CYP2J2单酶的近红外荧光探针底物，该化合物可以用来检测CYP2J2的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的CYP2J2酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP2J2的活性标定。该探针能够检测肿瘤中CYP2J2活性，并且能用于评估肿瘤迁徙过程中CYP2J2活性及其功能。此外，该探针还能用于血液中CYP2J2活性评估，以及评估血管新生过程中CYP2J2活性及其功能。选用本专利技术所述细胞色素氧化酶CYP2J2单酶的OFF-ON型近红外荧光探针反应检细胞色素氧化酶CYP2J2单酶体外活性具有以下突出优势：(1)高特异性：半菁羟基烷基化类化合物可被细胞色素氧化酶CYP2J2单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即O-脱烷氧基产物。(2)廉价易得：半菁羟基烷基化类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。(3)高灵敏度：具有半菁羟基烷基化类化合物均具有良好的近红外荧光发射光谱特性，能更好的减少背景荧光干扰，同时可通过OFF-ON型标准曲线的建立进行定量测定CYP2J2单酶的检测下限为0.024mg/mL。附图说明图1.半菁羟基烷基化类化合物的结构通式。图2.(E)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐的1H-NMR谱图。图3.(E)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐的13C-NMR谱图。图4.(E)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐及其O-脱烷氧基代谢产物的高分辨质谱图。图5.(E)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐的1H-NMR谱图。图6.(E)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐的13C-NMR谱图。图7.(E)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐及其O-脱烷氧基代谢产物的高分辨质谱图。图8.13例HLM对(E)-2-(2-6-((4-甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF‑ON型近红外荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被CYP2J2特异性催化生成相应的脱烷氧基产物，该底物具有(E)‑2‑(2‑6‑((4‑甲氧基苄基)氧基)‑2，3‑二氢‑1H‑氧杂蒽‑4‑yl)乙烯基)‑3,3‑二甲基‑1‑丙基‑3H‑吲哚‑碘盐（半菁羟基烷基化）类结构，其结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被CYP2J2特异性催化生成相应的脱烷氧基产物，该底物具有(E)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-碘盐（半菁羟基烷基化）类结构，其结构通式如下：其中，R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R3为H，F，Cl，Br。2.根据权利要求1所述的一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针底物的应用，其特征在于：采用该CYP2J2亚酶的特异性底物，与含CYP2J2的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其脱烷氧基产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP2J2的活性，具体测定方法及条件如下：A.体系中以半菁羟基烷基化衍生物作为OFF-ON型探针底物；底物浓度选择1/10~10Km；B.在PBS缓冲液中，反应温度为20oC至60oC之间；孵育体系pH介于5.5~10.5之间；C.反应时间为5~120分钟，确保以上底物相应的O-去烷氧基产物达到定量限，且底物转化率不超过20%时终止反应；D.测定单位时间内底物减少量或O-去烷氧基产物生成量，作为CYP2J2活性的评价指标；该探针底物及其去烷氧基产物的荧光信号需采用激发波长656nm，最大发射波长为718nm。3.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：马骁驰，崔京南，宁静，冯磊，刘涛，王博，于振龙，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21